400 và 800mg/kg
3.5.3.2. Thời gian đau quặn của lô chứng bệnh, chứng dương, Cao Kha
800mg/kg ở mô hình tiêm phúc mô acid acetic
*: p < 0,05 so với lô CB, **: p < 0,01 so với lô CB
Hình 3.17. Thời gian đau quặn của chuột ở lô Cao Khai 800 mg/kg Trong tất cả các khoảng thời gian khảo sát, thời gian đau quặn của lô Cao Khai 800 mg/kg đều giảm so với lô chứng bệnh. Đặc biệt trong 35 phút đầu, sự khác biệt này đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Tỷ lệ làm giảm thời gian đau
* ** ** * * * ** ** **** ** ** ** ** * 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0-5 >5-10 >10-15 >15-20 >20-25 >25-30 >30-35 >35-40 T hời gi an đau ở các lô chuột (gi ây)
Khoảng thời gian khảo sát (phút)
Lô CB Lô CD CK800
quặn của lô Cao Khai 800 mg/kg so với lô chứng bệnh được thể hiện ở Bảng 3.18.
Bảng 3.21. Tỷ lệ giảm thời gian đau quặn của lô Cao Khai 800 mg/kg so với lô chứng bệnh
Lô thử nghiệm
Khoảng thời gian (phút)
0 - 5 > 5 - 10 > 10 - 15 > 15 - 20 > 20 - 25 > 25 - 30 > 30 - 35 > 35 - 40
CK800 80,98% 75,02% 74,53% 82,10% 79,10% 79,02% 65,38% 40,91%
Cao Khai với liều 800 mg/kg dùng đường uống thể hiện tác động giảm thời gian đau quặn trong tất cả các khoảng thời gian từ 0 – 35 phút, tỷ lệ làm giảm thời gian đau trong khoảng thời gian này dao động từ 65,38% tới 82,10%. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa thời gian đau của lô Cao Khai 800 mg/kg so với lô chứng dương (p > 0,05).
Cao Khai với liều 800 mg/kg thể hiện tác động giảm đau ngoại biên trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic, thể hiện bằng việc làm giảm số lần đau quặn và thời gian đau quặn của chuột so với lô chứng bệnh.
3.5.4. Khảo sát tác động giảm đau trung ương trên mô hình nhúng đuôi chuột
3.5.4.1. Lựa chọn chuột vào thử nghiệm
Trong số 32 chuột thử nghiệm, toàn bộ có tiềm thời giật đuôi < 5 giây, đạt yêu cầu để cho vào thử nghiệm. Trong đó, tiềm thời giật đuôi ngắn nhất là 0,69s, dài nhất là 1,81s. Các chuột này được lựa chọn ngẫu nhiên vào 4 lô thử nghiệm: CB, CD, CK400, CK800 và tiến hành thí nghiệm.
3.5.4.2. Khảo sát mô hình gây đau bằng phương pháp nhúng đuôi chuột
Kết quả tiềm thời giật đuôi của các lô chuột thử nghiệm trên mô hình nhúng đuôi ở các thời điểm 0, 60, 90, 120, 150 phút được thể hiện ở Bảng 3.19.
Bảng 3.22. Tiềm thời giật đuôi của các lô chuột ở thử nghiệm nhúng đuôi (giây)
Lô thử nghiệm Thời điểm khảo sát (phút)
0 60 90 120 150
CB 1,34 ± 0,11 1,57 ± 0,18 1,95 ± 0,11 2,17 ± 0,14 1,91 ± 0,12
CD 1,32 ± 0,13 8,81** ± 0,61 7,63** ± 0,94 7,44** ± 1,26 7,10** ± 1,42
CK400 1,32 ± 0,11 1,73 ± 0,11 2,25 ± 0,17 2,32 ± 0,27 2,18 ± 0,14
CK800 1,21 ± 0,1 2,03 ± 0,16 2,22 ± 0,14 2,18 ± 0,19 2,42* ± 0,15
*: p < 0,05 so với lô CB, **: p < 0,01 so với lô CB
Trước khi uống thuốc thử nghiệm (thời điểm 0), các chuột được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tiềm thời cảm nhận đau giữa 4 lô. Tiếp tục so sánh tiềm thời tại các thời điểm 60, 90, 120,150 phút sau khi uống thuốc giữa các lô để khảo sát tác dụng giảm đau của thuốc thử nghiệm.
Kết quả tiềm thời giật đuôi chuột ở các thời điểm khảo sát của lô chứng bệnh và lô chứng dương được thể hiện ở Hình 3.18.
**: p < 0,01 so với lô CB
Hình 3.18. Tiềm thời giật đuôi của lô chứng bệnh và lô chứng dương
** ** ** ** 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 60 90 120 150 T iềm t hờ i gi ật đuôi ở các lô chuột (gi ây)
Thời điểm khảo sát (phút)
Lô CB Lô CD
Ở tất cả các thời điểm khảo sát sau khi uống thuốc, chuột ở lô chứng dương có tiềm thời giật đôi dài hơn rõ rệt so với lô chứng bệnh chứng tỏ morphin đã thể hiện tác dụng giảm đau ở chuột (p < 0,01). Ở mốc thời gian bắt đầu thử nghiệm, sự khác biệt là không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Như vậy, thử nghiệm đã thực hiện thành công gây đau cho chuột bằng nhiệt và mô hình có đáp ứng với thuốc đối chứng morphin, thích hợp để khảo sát tác động giảm đau trung ương của cao dược liệu.
3.5.5. Khảo sát tác dụng giảm đau trung ương của Cao Khai
Kết quả tiềm thời giật đuôi của lô chứng bệnh, chứng dương, Cao Khai 400mg/kg và Cao Khai 800mg/kg ở mô hình nhúng đuôi chuột được thể hiện ở Hình 3.19.
Ở mốc thời gian bắt đầu thử nghiệm, sự khác biệt là không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Tiếp đó, ở tất cả các thời điểm 60, 90, 120 và 150 phút sau khi uống thuốc, tiềm thời giật đuôi ở lô Cao Khai 400 mg/kg và Cao Khai 800 mg/kg đều dài hơn so với lô chứng bệnh, nhưng sự khác biệt chỉ có ý nghĩa thống kê với lô Cao Khai 800 mg/kg tại thời điểm 150 phút sau khi uống thuốc (p < 0,05). Tuy nhiên, tiềm thời giật đuôi trung bình của lô CK800 tại thời điểm này chỉ đạt 2,42 giây chứng tỏ Cao Khai 800 mg/kg chỉ cho hiệu quả giảm đau trung ương yếu [41]. Khi so sánh tiềm thời giật đuôi của lô Cao Khai 800 mg/kg so với lô chứng dương ở cùng thời điểm 150 phút sau khi uống thuốc cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p< 0,01), cho thấy tuy Cao Khai với liều 800 mg/kg có tác dụng giảm đau trung ương ở tại thời điểm này nhưng hiệu quả không đạt được bằng thuốc đối chứng là morphin. Để có kết luận chính xác hơn về tác động giảm đau trung ương của Cao Khai, có thể tiến hành khảo sát ở một số mô hình khác hoặc thực hiện tăng thời gian sử dụng Cao Khai (uống cao khai 7 – 14 ngày rồi tiến hành khảo sát tác động giảm đau)
**: p < 0,01 so với lô CB
Hình 3.19. Tiềm thời giật đuôi các lô chuột thử nghiệm
Cao Khai với liều 400 mg/kg chưa thể hiện tác dụng giảm đau trung ương. Cao Khai với liều 800 mg/kg chỉ thể hiện tác động giảm đau trung ương yếu ở thời điểm 150 phút của thử nghiệm.
** ** ** ** * 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 60 90 120 150 T iềm t hời g iậ t đu ôi ở cá c lô chuộ t (g iâ y)
Thời điểm khảo sát (phút)
Lô CB Lô CD CK400 CK800
BÀN LUẬN KẾT QUẢ
Về thành phần hóa lý và các hoạt tính sinh học có trong Cao Khai
Kết quả khảo sát vi học bột Cao Khao cho thấy, không còn nhận thấy sự hiện diện của các cấu tử có trong bột dược liệu, chứng tỏ cao chiết đã được xử lý tốt trong quá trình chế biến. Về độ ẩm, Cao Khai có hàm ẩm khá thấp đạt 10,43% - phù hợp cho bảo quản, tránh được sự phát triển của vi sinh vật gây hại đến chất lượng và vòng đời sản phẩm. Độ tro toàn phần và tro không tan trong acid nằm trong ngưỡng phù hợp cho thấy nguyên liệu đảm bảo được chất lượng trước khi chế biến.
Kết quả đánh giá thành phần hóa thực vật cho thấy Cao Khai hiện diện đa dạng các hợp chất có giá trị như Acid hữu cơ, anthraquinon, coumarin, flavonoid, hợp chất khử, polyuronid, saponin, tinh dầu, triterpenoid và polyphenol. Những hợp chất này đã được chứng minh là nhân tố tạo nên hoạt tính sinh học cho được liệu và kết quả phù hợp với những nghiên cứu trước đó về thành phần hóa thực vật có trong dây Khai [64]. Trong đó, các hợp chất flavonoid là một nhóm các hợp chất polyphenol được xem như chất chống oxi hóa mạnh hơn vitamin C, vitamin E và carotenoid [56]. Chất chống oxi hóa là các hợp chất có thể trì hoãn, ức chế hoặc ngăn chặn quá trình oxi hóa gây ra bởi các gốc tự do và giảm bớt tình trạng stress oxi hóa [61]. Stress oxi hóa là một trạng thái mất cân bằng do số lượng gốc tự do sản sinh quá nhiều vượt qua khả năng chống oxi hóa nội sinh, dẫn đến quá trình oxi hóa của một loại đại phân tử sinh học, như các enzyme, protein, DNA và lipid. Stress oxi hóa là nguyên nhân quan trọng trong sự phát triển của các bệnh thoái hóa mãn tính bao gồm bệnh mạch vành tim, ung thư và lão hóa. Khả năng chống oxi hóa của flavonoid có thể được giải thích dựa vào các đặc điểm cấu trúc phân tử của chúng. Trong phân tử flavonoid có chứa các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng nhường hydro giúp chúng có thể tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ các gốc tự do. Ngoài ra, do phân tử có chứa các vòng thơm và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên hợp giúp
giúp làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động. Cao Khai được đánh giá và cho thấy có chứa lượng lớn các giá trị hoạt tính sinh học và chúng là cơ sở cho những tác dụng sinh học của Cao Khai đối với cơ thể con người trong thực tế sử dụng.
Về độc tính cấp của sản phẩm Cao Khai
Theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới, tất các các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu đều phải đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên động vật thực nghiệm trước khi đưa vào thử nghiệm trên người [68]. Sản phẩm Cao Khai có nguồn gốc từ một bài thuốc cổ phương của dân tộc Re thuộc khu vực miền Trung Việt Nam dùng làm thuốc bổ máu, thông kinh, chữa thấp khớp đau mình mẩy, lưng và đầu gối mỏi, vết tụ máu bầm tím, trừ thấp nhiệt, phù thũng, dùng cho phụ nữ sau khi sinh đẻ uống cho có nhiều sữa, máu huyết lưu thông, da dẻ hồng hào,… Theo thời gian, sản phẩm đã được sử dụng phổ biến rộng rãi không chỉ ở trong nước mà còn được lưu hành đến các quốc gia lân cận trong khu vực.
Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của sản phẩm cho thấy chuột nhắt trắng đã uống Cao Khai ở nồng độ cao tương đương 5000 mg/kg trọng thể chuột trong 24 giờ nhưng không ghi nhận trường hợp chuột chết, các chuột vẫn khỏe mạnh, lông mượt, mắt trong, ăn uống, hoạt động bình thường và không có sự xuất hiện của các triệu chứng bất thường nào trong 72 giờ sau uống thuốc lần đầu cũng như trong suốt những ngày tiếp theo sau khi dùng cao. Đại thể chuột sau 14 ngày thử nghiệm không có hiện tượng bất thường.
Khối lượng cơ thể của động vật là thông số quan trọng để nghiên cứu độc tính, các tác nhân hoặc chất độc gây ra các phản ứng trao đổi chất bất thường trong cơ thể có thể làm thay đổi khối lượng cơ thể chuột. Khối lượng cơ thể có mối tương quan chặt chẽ với lượng thức ăn tiêu thụ. Khi có độc tính, khẩu phần ăn bình thường của động vật bị ảnh hưởng gây giảm khối lượng cơ thể [69]. Thể trọng chuột của cả 2 lô đều tăng so với ngày đầu tiên của nghiên cứu. Không ghi nhận khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự gia tăng trọng lượng giữa lô sinh lý và lô dùng Cao Khai ở liều 5000 mg/kg (p>0,05). Do đó, việc
sử dụng Cao Khai không làm ảnh hưởng xấu đến đại thể chung và trọng lượng của chuột.
So với liều có hiệu quả ở thử nghiệm chống viêm, giảm đau (ở mục 3.4 và 3.5) trên chuột nhắt trắng là 400 mg/kg và 800 mg/kg trọng lượng chuột, liều 5000 mg/kg trọng lượng chuột gấp lần lượt 12,5 lần và 6,25 lần mức liều dự kiến có kết quả. Tuy nhiên, chuột vẫn khỏe mạnh, không có biểu hiện co giật, tiêu chảy hay xù lông, thở gấp, vẫn hoạt động bình thường cũng như không có chuột nào chết. Theo lý thuyết, một chất được xem là có khoảng an toàn điều trị tốt khi LD50 lớn hơn giới hạn từ 1/5 đến 1/20 của liều điều trị. Cao Khai được dùng ở liều cao gấp lần lượt 6,25 lần và 12,5 lần mức liều hiệu quả nhưng không gây chết chuột hay có sự xuất hiện triệu chứng bất thường nào trong suốt thời gian thử nghiệm. Điều này cho thấy sản phẩm Cao Khai có tính an toàn cao và được xếp vào phân loại 6 – chất gần như không có độc tính (Theo GSH - Globally Harmonised System for Classification of Chemicals) [31].
Bên cạnh đó, Cao Khai không gây ra sự khác biệt đáng kể trên chức năng tạo máu (về số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu), chức năng thận của chuột thử nghiệm. Tuy ở liều 5000 mg/kg, Cao Khai có làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme gan ALT, AST so với lô sinh lý, nhưng vẫn nằm trong ngưỡng giới hạn bình thường của chuột. Kết quả này phù hợp với báo cáo trước đó của tác giả trong nước như Nguyễn Thanh Xuân (2011) khi nghiên cứu độc tính của sản phẩm Cao Khai [44]. Song song đó, kết quả ghi nhận chỉ số Ure và Creatinine giảm so với lô sinh lý, tuy chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05) nhưng nhìn chung, việc sử dụng Cao Khai trong thử nghiệm này không làm ảnh hưởng đến chức năng thận.
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kinh nghiệm sử dụng của người dân bản địa vì cho đến nay chưa ghi nhận bất kỳ trường hợp ngộ độc nào xảy ra khi sử dụng sản phẩm Cao Khai.
Về độc tính bán trường diễn của sản phẩm Cao Khai
Trong thực tế, việc sử dụng sản phẩm Cao Khai thường phải dùng trong một thời gian dài nên để xác định được tính an toàn của bài thuốc, ngoài việc nghiên cứu độc tính cấp thì tiến hành đánh giá độc tính bán trường diễn cũng được triển khai. Theo tài liệu nghiên cứu của GS. TSKH Đỗ Trung Đàm, liều thử tác động dược lý vào khoảng 1/10 LD50 (trong giới hạn từ 1/5 tới 1/20 của LD50) [28]. Tuy nhiên, theo hướng dẫn của Cục Khoa học Công nghệ và Đào tạo (Bộ Y tế) về thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc Đông y, thuốc từ dược liệu (ban hành tại Quyết định số 141/QĐ - K2DT ngày 27/10/2015), tính toán liều tương đương giữa chuột nhắt trắng và con người được thực hiện như sau: 5000 mg/kg x 0,085 = 425 mg/kg khối lượng cơ thể người (gấp 10 lần chuột). Nếu tính cho người lớn có khối lượng khoảng 50 kg, liều có tác dụng gây độc gần đúng là: 425 mg/kg x 50 = 21,250 mg/kg (21.250 g/kg). Mức độ này lớn hơn gấp 4,5 lần so với giá trị 5000 mg/kg - được xem là liều gần như không độc đối với người (Cục Khoa học Công nghệ và Đào tạo, 2015). Bất kỳ loại dược phẩm hoặc hợp chất nào có LD50 qua đường miệng cao hơn 1000 mg/kg đều có thể được coi là an toàn và ít độc hại (Adeneye and Olagunju, 2009). Hiện nay, chưa có nghiên cứu nào công bố khả năng và các thành phần gây độc cấp tính của sản phẩm Cao Khai ở LD50 gần đúng là 5000 mg/kg.
Căn cứ vào kết quả trên, sản phẩm Cao Khai được xếp vào loại chất gần như không có độc tính – thuộc phân loại 6 theo GSH, nghiên cứu đã sử dụng liều 400 mg/kg để tiến hành đánh gia độc tính bàn trường diễn trên chuột nhắt trắng trong 12 tuần.
Ảnh hưởng của sản phẩm Cao Khai đến tình trạng chung, thể trọng của chuột và cơ quan tạo máu
Trong suốt thời gian sử dụng sản phẩm Cao Khai, chuột ở cả 2 lô (lô sinh lý và lô sử dụng Cao Khai ở liều 400 mg/kg thể trọng chuột) đều hoạt động bình thường, mắt sáng, nhanh nhẹn, ông mượt, ăn uống tốt, phân khô ráo và không ghi nhận bất kỳ biểu hiện khác thường nào ở cả 2 lô trong suốt thời gian nghiên cứu.
Trọng lượng chuột ở cả 2 lô nghiên cứu đều tăng có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với trước nghiên cứu. Không ghi nhận sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự gia tăng trọng lượng giữa lô sinh lý và lô sử dụng Cao Khai ở liều 400 mg/kg thể trọng chuột (Bảng 3.13). Như vậy, kết quả cho thấy việc sử dụng