400 và 800mg/kg
2.3.6.2. Khảo sát độc tính bán trường diễn trên đường uống của chuột nhắt
nhắt trắng
Thí nghiệm khảo sát độc tính bán trường diễn của cao chiết được tiến hành theo phương pháp của Kandimalla et al. (2016) có hiệu chỉnh [47].
Các cao chiết được thử nghiệm ở liều 400 mg/kg khối lượng chuột liện tục trong 90 ngày. Sau đó, chuột được rút máu ở tim để xét nghiệm công thức máu và một số chỉ tiêu sinh hóa. Chuột khỏe mạnh sau khi cân trọng lượng được chọn ngẫu nhiên và chia thành 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 6 con chuột. Các nghiệm thức được bố trí như sau:
Nghiệm thức 1: Chuột bình thường uống nước cất (đối chứng sinh lý). Nghiệm thức 2: Chuột bình thường uống cao chiết liều 400 mg/kg pha trong DMSO 1%.
Chỉ tiêu phân tích: Tỉ lệ chuột chết, trọng lượng chuột, sinh hóa như urê, creatinin, AST (SGOT), ALT (SGPT), công thức máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu).
2.3.7. Khảo sát tác động kháng viêm cấp trên mô hình gây viêm bàn chân chuột bằng carrageenan
và β-(1,4)-3,6-hydroD-galactose. Do là hợp chất cao phân tử nên khi vào trong cơ thể, carrageenan trở thành kháng nguyên thông qua cơ chế miễn dịch kháng nguyên - kháng thể. Mức độ viêm tối đa ở trong thời gian 3-5 giờ. Mẫu có tác dụng kháng viêm sẽ làm giảm mức độ phù chân chuột. Carragenan gây viêm cấp theo 2 pha: pha 1 giải phóng histamine, serotonin; pha 2 giải phóng bradykinin, protease, prostaglandin, lysosom [48].
Thực hiện:
Mẫu thử: Cao Khai sản xuất tại Ninh Thuận
Chuẩn bị dung dịch chống thấm: 250mg NaCl trong 500ml nước cất + 1ml dung dịch chống thấm.
Chuẩn bị dung dịch gây viêm: ngâm carrageenan 1% trong NaCl 0,9% trước 3 giờ cho trương nở hoàn toàn.
Đầu tiên, tất cả chuột được đo thể tích chân chuột bình thường (V0) trên máy Plethysmometer. Nhúng chân phải của chuột vào dung dịch chống thấm đến khuỷu chân, nhấn giữ bàn đạp để cố định, ghi nhận thể tích trên máy, tiến hành đo 3 lần và lấy kết quả trung bình. Sau đó, chuột được phân lô ngẫu nhiên thành 5 lô sao cho V0 khác biệt không có ý nghĩa thống kê (8 chuột/lô)
Lô 1 (sinh lý): cho chuột uống nước cất Lô 2 (chứng bệnh): cho chuột uống nước cất
Lô 3 (đối chứng): cho chuột uống thuốc diclofenac liều 5 mg/kg.
Lô 4 (Cao khai 1): cho chuột uống cao khai liều D1 (căn cứ theo kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống hoặc liều dùng trên người).
Lô 5 (Cao khai 2): cho chuột uống cao khai liều D2 (căn cứ theo kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống hoặc liều dùng trên người).
Chuột được nhịn đói 12 giờ và cho uống nước cất hoặc diclofenac hoặc cao thử với thể tích 10 ml/kg trọng lượng chuột. Sau khi uống nước cất, diclofenac và mẫu thử 1 giờ, chuột ở các lô từ 2 đến 5 được tiêm 0,025 ml dịch treo carrageenan 1% vào gan bàn chân phải sau để gây viêm bàn chân; chuột lô sinh lý được tiêm dung dịch NaCl 0,9%. Sau đó, tất cả chuột được cho vào lồng
có giá đỡ để tránh nhiễm trùng chân. Đo thể tích bàn chân chuột lần lượt sau 1, 3, 5, 24, 48, 72, 96, 120, 144 giờ (Vt) sau khi gây viêm.
Mức độ phù bàn chân chuột X (%) được tính theo công thức X (%) = (Vt-V0)/V0 x 100
Trong đó :
Vt: thể tích chân chuột tại thời điểm t sau khi gây viêm (ml) Vo: thể tích chân chuột tại thời điểm trước khi gây viêm (ml)
Sau khi đo thể tích bàn chân ở thời điểm 24, 48, 72, 96, 120 và 144 giờ, chuột được cho uống nước cất, diclofenac hoặc mẫu thử 01 lần/ngày.
Các lô cao khai và lô đối chứng được khảo sát về hiệu quả kháng viêm tương đối thông qua khả năng giảm độ phù bàn chân chuột I (%) được tính theo công thức:
I (%) = (X1-X2) / (X1-X3) * 100% Trong đó:
X1: độ phù chân chuột của lô chứng bệnh
X2: độ phù chân chuột của lô cao khai hoặc độ phù chân của lô đối chứng. X3: độ phù chân chuột của lô sinh lý.
2.3.8. Đánh giá tác dụng giảm đau của sản phẩm Cao Khai
2.3.8.1 Khảo sát tác động giảm ngoại biên bằng phương pháp gây đau quặn bằng acid acetic quặn bằng acid acetic
Trước khi khảo sát tác động giảm đau của Cao Khai, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát độc tính cấp nhằm tạo cơ sở để chọn liều cho thử nghiệm. Chuột nhịn đói ít nhất 12 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm, chia ngẫu nhiên thành 2 lô, mỗi lô gồm 6 chuột. Lô đối chứng sinh lý uống nuốc cất, lô thử
lệ tử vong của chuột trong vòng 14 ngày [49, 50]. Kết quả cho thấy sau khi uống Cao Khai với liều 5000 mg/kg, chuột không có biểu hiện bất thường, tỷ lệ sống sau 14 ngày là 100%. Cao Khai không gây ra tính cấp cho chuột thí nghiệm ở liều 5000 mg/kg trọng lượng chuột chứng tỏ giá trị LD50sẽ cao hơn liều này. Liều cho tác động dược lý thường trong khoảng 1/20 tới 1/5 của LD50 [50]. Từ đó, đề tài sử dụng liều 400 mg/kg và 800 mg/kg để tiến hành thử nghiệm khảo sát tác dụng giảm đau của cao thuốc.
Đề tài lựa chọn diclofenac, một thuốc thuộc nhóm NSAID, với liều 5 mg/kg sử dụng làm thuốc đối chứng trong thử nghiệm giảm đau ngoại biên [51].
Chia chuột ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô gồm 8 con. Điều kiện cho uống là 0,1 ml/10g thể trọng chuột. Lô chứng bệnh (CB): Uống nước cất.
Lô chứng dương (CD): Uống diclofenac với liều 5mg/kg.
Lô thử nghiệm 1 (CK400): Uống Cao Khai với liều 400 mg/kg thể trọng chuột.
Lô thử nghiệm 1 (CK800): Uống Cao Khai với liều 800 mg/kg thể trọng chuột.
Sau khi dùng thuốc 60 phút, tất cả các chuột được gây đau bằng cách tiêm phúc mô dung dịch acid acetic 1% pha trong nước muối sinh lý. Mỗi chuột được đặt vào bocal thủy tinh riêng.
Đếm số lần và thời gian đau quặn ở chuột (biểu hiện: toàn thân vươn dài, ưỡn cong người, một hoặc cả hai chân sau duỗi ra, hóp bụng) mỗi 5 phút trong vòng 40 phút sau thời điểm tiêm dung dịch acid acetic. So sánh số lần đau quặn và thời gian đau quặn ở cùng thời điểm giữa các lô. Nếu số lần đau và thời gian đau ở lô thử giảm so với lô chứng bệnh thì chứng tỏ chất thử nghiệm có tác dụng giảm đau ngoại biên.
Hình 2.3. Biểu hiện chuột đau quặn ở thử nghiệm khảo sát tác động giảm đau ngoại biên
2.3.8.2. Khảo sát tác động giảm đau trung ương bằng phương pháp nhúng đuôi chuột nhúng đuôi chuột
Khảo sát tác động giảm đau trung ương bằng phương pháp nhúng đuôi chuột. Đề tài lựa chọn morphin, một chất giảm đau trong nhóm opioids để làm thuốc đối chứng trong thử nghiệm giảm đau trung ương [52].
Phương pháp ghi nhận tiềm thời cảm nhận đau của chuột:
Cài đặt bếp cách thủy ở nhiệt độ 52 ± 0,50C. Nhúng đuôi chuột vào nước nóng. Sử dụng đồng hồ bấm giây để ghi nhận tiềm thời của chuột, bắt đầu từ lúc nhúng đuôi vào nước và kết thúc khi đuôi quẫy mạnh ra khỏi nước. Đo 2 lần liên tiếp ở mỗi thời điểm và ghi nhận tiềm thời dài hơn. Dùng bông gòn lau khô đuôi chuột sau mỗi lần nhúng. Các chuột được nhốt riêng và đảm bảo ở điều kiện nhiệt độ, ánh sáng ổn định để tránh ảnh hưởng đến kết quả.
Nếu sau 10 giây chuột vẫn không có phản ứng thì cần rút đuôi chuột ra khỏi nước nóng để tránh tổn thương đuôi chuột và ghi nhận tiềm thời là 10 giây [53].
Chuẩn bị chuột thí nghiệm:
Trước khi thực hiện thí nghiệm, đo tiềm thời cảm nhận đau của chuột, ghi nhận tiềm thời tại thời điểm 0 (t0).
Những con chuột có tiềm thời cảm nhận đau không quá 5 giây được lựa chọn vào thí nghiệm này.
Điều kiện cho uống là 0,1 ml/10g thể trọng chuột. Lô chứng bệnh (CB): Uống nước cất.
Lô chứng dương (CD): Uống morphin, liều 5mg/kg trọng lượng chuột [52].
Lô thử nghiệm 1 (CK400): Uống Cao Khai với liều 400 mg/kg thể trọng chuột.
Lô thử nghiệm 1 (CK800): Uống Cao Khai với liều 800 mg/kg thể trọng chuột.
Tiếp tục ghi nhận tiềm thời tại các thời điểm 60, 90, 120, 150 phút sau khi uống chất thử nghiệm.
So sánh tiềm thời cảm nhận đau giữa các lô. Nếu tiềm thời của lô thử kéo dài hơn so với lô chứng bệnh thì chứng tỏ chất thử nghiệm có tác dụng giảm đau trung ương.
Hình 2.4. Biểu hiện giật đuôi của chuột ở thử nghiệm giảm đau trung ương
2.4. XỬ LÝ KẾT QUẢ VÀ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ
Kết quả được xử lý thống kê bằng chương trình Statghraphics Centurions 18.1.12 và Microsoft Excel 365. Phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD được sử dụng để kết luận về sự sai khác giữa nghiệm thức. Kết quả được trình bày ở dạng giá tri ̣trung bình ± SEM (standard error of mean - sai số chuẩn của số trung bình).
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA LÝ CỦA CAO KHAI
3.1.1. Kết quả khảo sát vi học bột Cao Khai
Đặc điểm bột cao: Bột màu nâu đen, có mùi thơm đặc trưng của cao, vị đắng, hơi chát.
Soi bột cao trên kính hiển vi tìm thấy rất nhiều tinh thể có hình dạng và kích thước khác nhau. Nhận thấy trong Cao Khai chứa nhiều tinh thể cấu trúc tương tự nhau nhưng khác kích thước, có thể do trong quá trình nấu Cao Khai dùng nhiệt độ cao và khuấy trộn nhiều, nên các tinh thể lớn hơn bị vỡ ra tạo nhiều mảnh nhỏ hơn. Không còn nhận thấy sự hiện diện của các cấu tử có trong bột dược liệu, chứng tỏ cao chiết đã được xử lý tốt trong quá trình chế biến.
Hình 3.1. Hình ảnh vi học của bột cao dây Khai
3.1.2. Xác định độ ẩm
Cao Khai được nghiền nhuyễn và rây rây qua rây 0,5mm để thu được bột Cao Khai có kích thước đồng nhất.
Hình 3.2. Cao Khai và bột Cao Khai
Sau đó, bột Cao Khai được tiến hành xác định độ ẩm theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 12.16.
Bảng 3.1. Độ ẩm bột Cao Khai
STT Khối lượng mẫu (g) Độ ẩm (%)
1 2,0018 10,70
2 2,0010 10,00
3 2,0013 10,60
Trung bình 2,0014 10,43 ± 0,38
Kết quả cho thấy độ ẩm của Cao Khai khá thấp (10,43 %), thích hợp cho việc bảo quản, tuy nhiên cao Khai chưa đạt tiêu chuẩn độ ẩm của cao khô (<5%) mà chỉ đạt tiêu chuẩn của cao đặc (< 20%).
3.1.3. Xác định độ tro toàn phần
Bột Cao Khai được tiến hành xác định độ tro toàn phần theo theo tiêu chuẩn DĐVN 5, phụ lục 9.8, (Tr. PL-204)
Bảng 3.2. Độ tro toàn phần của bột Cao Khai
STT Khối lượng mẫu (g) Độ tro (%)
1 1,0044 9,33
2 1,0019 10,01
3 1,0003 8,72
Trung bình 1,0022 9,35 ± 0,64
3.1.4. Xác định độ tro không tan trong acid
Bột Cao Khai được tiến hành xác định độ không tan theo theo tiêu chuẩn DĐVN 5, phụ lục 9.7, (Tr. PL-203)
Bảng 3.3. Độ tro không tan trong acid của bột Cao Khai
STT Khối lượng mẫu (g) Độ tro (%)
1 1,0044 0,51
2 1,0019 0,47
3 1,0003 0,55
Trung bình 1,0022 0,51 ± 0,04
Kết quả cho thấy độ tro toàn phần của mẫu bột Cao Khai là 0,51 % chứng tỏ dược liệu đã được xử lý kỹ càng trước và sau khi sấy, đảm bảo chất lượng của dược liệu.
3.1.4. Kết quả sơ bộ thành phần hóa thực vật của Cao Khai
Bằng các phản ứng hóa học đặc trưng, đã xác định được một số nhóm hợp chất có mặt trong Cao Khai (bảng 3.2).
Bảng 3.4. Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật trong Cao Khai
Nhóm hợp chất
Phân đoạn Diethyl ete Phân đoạn Ethanol Phân đoạn nước Kết luận
Acid hữu cơ // + +/- +
Alkaloid - - - - Anthraquinon + + + + Carotenoid - // // +/- Chất béo - // // +/- Coumarin + + // + Flavonoid - +/- - +/- Glycosid tim + + + + Hợp chất khử // + + + Polyphenol // + + + Polyuronid // // + + Saponin // + + + Tannin // - - - Tinh dầu + // // + Triterpenoid + + + +
Hình 3.3. Các phản ứng xác định thành phần hóa thực vật định tính: Anthraquinon (a), saponin (b), glycosid tim (c), triterpenoid (d), flavonoid
(e), chất khử (f)
Kết quả phân tích sơ bộ cho thấy trong Cao Khai cũng chứa đa dạng các nhóm hợp chất tự nhiên, trong đó bao gồm: Acid hữu cơ, anthraquinon, coumarin, flavonoid, hợp chất khử, polyuronid, saponin, tinh dầu, triterpenoid và polyphenol. Kết quả này đã thể hiện Cao Khai là một sản phẩm có giá trị cao, qua đó, tiến hành tiếp tục phân tích định lượng một số hợp chất quan trọng trong Cao Khai thông qua những thử nghiệm tiếp theo.
3.2. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ NHÓM HOẠT CHẤT CHÍNH
3.2.1. Hàm lượng saponin tổng
Hàm lượng saponin tổng được xác định bằng phương pháp cân, dựa theo Dược điển Việt Nam IV. Kết quả được nêu trong bảng 3.3.
Bảng 3.5. Hàm lượng saponin tổng của Cao Khai
STT Khối lượng mẫu (g) Khối lượng cắn saponin thu được (g) Độ ẩm mẫu (%) Saponin tổng (%) 1 0,5020 0,0655 10,43 14,57 2 0,5007 0,0742 10,43 16,54 3 0,5034 0,0674 10,43 14,95 Trung bình 15,35 ± 1,05
Kết quả cho thấy, hàm lượng saponin tổng trong Cao Khai đạt giá trị khá cao (15,35 %). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, saponin là nhóm hợp chất mang lại nhiều lợi ích tuyệt vời cho sức khỏe cho con người như: Điều hòa cholesterol trong máu, chống ung thư, giúp sự hoạt động của xương thêm chắc khỏe và kích thích hệ miễn dịch tự nhiên, chống mệt mỏi, bảo vệ gan, giảm stress ... Chính vì vậy, sự có mặt với hàm lượng cao các hợp chất saponin trong “Cao Khai” cũng đã phần nào giải thích một số tác dụng dược lý, cũng như giá trị làm thuốc của loài cây này.
3.2.2. Hàm lượng anthranoid toàn phần
Bảng 3.6. Hàm lượng anthranoid toàn phần của Cao Khai
STT Khối lượng mẫu (g) Khối lượng cắn anthranoid thu được (g) Độ ẩm mẫu (%) Anthranoid toàn phần (%) 1 2,0020 0,665 10,40 0,37 2 2,0008 0,790 10,40 0,44 3 2,0004 0,702 10,40 0,39 Trung bình 0,4 ± 0,03
Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng anthranoid toàn phần trong Cao khai ở mức 0,4 ± 0,03 (%). Đã có nhiều báo cáo về công dụng của anthranoid như tác dụng chống loét, chống co thắt, kháng khuẩn, chống viêm, chống oxy
những tác dụng như hỗ trợ hệ tiêu hóa, nhuận tràng và gây xổ mạnh. Việc sử dụng thuốc có hàm lượng anthranoid cao trong thời gian dài có thể gây ra tiêu chảy, buồn nôn, giảm kali máu thậm chí liệt ruột và sinh ra chất có khả năng gây ung thư ruột. Kết quả đã chứng minh Cao khai có chứa anthranoid và bước đầu có thể minh chứng cho những tác dụng sinh học của sản phẩm khi sử dụng trong thực tế.
3.2.3. Hàm lượng polyphenol, flavonoid và saponin triterpenoid
Hàm lượng polyphenol, flavonoid và saponin triterpenoid được xác định bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis với các chất chuẩn lần lượt là acid gallic, quercetin và acid oleanolic. Kết quả được biểu diễn theo μg đương lượng chất chuẩn tương ứng có trong 1 mg cao khô đem định lượng (Hình 3.4).
Hình 3.4. Hàm lượng polyphenol, flavonoid và saponin triterpenoid có trong Cao Khai
Phenolic là một trong những thành phần quan trọng nhất và chiếm tỉ lệ lớn trong thực vật nói chung. Đây là những chất chống oxi hóa mạnh. Vì vậy, chỉ tiêu này khá quan trọng trong nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của thực vật. Hơn nữa, theo Marja và các đồng sự, những loại thực vật có hàm lượng phenolic tổng lớn hơn 20 µgGAE/mg được xem là có hoạt tính chống oxi hóa mạnh [54]. Kết quả định lượng cho thấy sự có mặt với hàm lượng khá cao của
49,67 5,94 35,79 0 10 20 30 40 50 60 Polyphenol (µgGAE/mg) Flavonoid (µgQE/mg) Saponin triterpenoid (µgOAE/mg) μ g/ m g
nhóm hợp chất polyphenol và flavonoid trong Cao Khai có tiềm năng là một nguồn chất chống oxi hóa tự nhiên dồi dào. Việc đánh giá các hợp chất này dựa trên những tác dụng sinh học của chúng đã được báo cáo và chứng minh trước đó. Ví dụ như hợp chất flavonoid hay các hợp chất polyphenol tổng, bên cạnh những tác dụng sinh học như hỗ trợ tim mạch (nhóm catechin), làm bền thành