400 và 800mg/kg
3.5.5. Khảo sát tác dụng giảm đau trung ương của Cao Khai
Kết quả tiềm thời giật đuôi của lô chứng bệnh, chứng dương, Cao Khai 400mg/kg và Cao Khai 800mg/kg ở mô hình nhúng đuôi chuột được thể hiện ở Hình 3.19.
Ở mốc thời gian bắt đầu thử nghiệm, sự khác biệt là không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Tiếp đó, ở tất cả các thời điểm 60, 90, 120 và 150 phút sau khi uống thuốc, tiềm thời giật đuôi ở lô Cao Khai 400 mg/kg và Cao Khai 800 mg/kg đều dài hơn so với lô chứng bệnh, nhưng sự khác biệt chỉ có ý nghĩa thống kê với lô Cao Khai 800 mg/kg tại thời điểm 150 phút sau khi uống thuốc (p < 0,05). Tuy nhiên, tiềm thời giật đuôi trung bình của lô CK800 tại thời điểm này chỉ đạt 2,42 giây chứng tỏ Cao Khai 800 mg/kg chỉ cho hiệu quả giảm đau trung ương yếu [41]. Khi so sánh tiềm thời giật đuôi của lô Cao Khai 800 mg/kg so với lô chứng dương ở cùng thời điểm 150 phút sau khi uống thuốc cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p< 0,01), cho thấy tuy Cao Khai với liều 800 mg/kg có tác dụng giảm đau trung ương ở tại thời điểm này nhưng hiệu quả không đạt được bằng thuốc đối chứng là morphin. Để có kết luận chính xác hơn về tác động giảm đau trung ương của Cao Khai, có thể tiến hành khảo sát ở một số mô hình khác hoặc thực hiện tăng thời gian sử dụng Cao Khai (uống cao khai 7 – 14 ngày rồi tiến hành khảo sát tác động giảm đau)
**: p < 0,01 so với lô CB
Hình 3.19. Tiềm thời giật đuôi các lô chuột thử nghiệm
Cao Khai với liều 400 mg/kg chưa thể hiện tác dụng giảm đau trung ương. Cao Khai với liều 800 mg/kg chỉ thể hiện tác động giảm đau trung ương yếu ở thời điểm 150 phút của thử nghiệm.
** ** ** ** * 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 60 90 120 150 T iềm t hời g iậ t đu ôi ở cá c lô chuộ t (g iâ y)
Thời điểm khảo sát (phút)
Lô CB Lô CD CK400 CK800
BÀN LUẬN KẾT QUẢ
Về thành phần hóa lý và các hoạt tính sinh học có trong Cao Khai
Kết quả khảo sát vi học bột Cao Khao cho thấy, không còn nhận thấy sự hiện diện của các cấu tử có trong bột dược liệu, chứng tỏ cao chiết đã được xử lý tốt trong quá trình chế biến. Về độ ẩm, Cao Khai có hàm ẩm khá thấp đạt 10,43% - phù hợp cho bảo quản, tránh được sự phát triển của vi sinh vật gây hại đến chất lượng và vòng đời sản phẩm. Độ tro toàn phần và tro không tan trong acid nằm trong ngưỡng phù hợp cho thấy nguyên liệu đảm bảo được chất lượng trước khi chế biến.
Kết quả đánh giá thành phần hóa thực vật cho thấy Cao Khai hiện diện đa dạng các hợp chất có giá trị như Acid hữu cơ, anthraquinon, coumarin, flavonoid, hợp chất khử, polyuronid, saponin, tinh dầu, triterpenoid và polyphenol. Những hợp chất này đã được chứng minh là nhân tố tạo nên hoạt tính sinh học cho được liệu và kết quả phù hợp với những nghiên cứu trước đó về thành phần hóa thực vật có trong dây Khai [64]. Trong đó, các hợp chất flavonoid là một nhóm các hợp chất polyphenol được xem như chất chống oxi hóa mạnh hơn vitamin C, vitamin E và carotenoid [56]. Chất chống oxi hóa là các hợp chất có thể trì hoãn, ức chế hoặc ngăn chặn quá trình oxi hóa gây ra bởi các gốc tự do và giảm bớt tình trạng stress oxi hóa [61]. Stress oxi hóa là một trạng thái mất cân bằng do số lượng gốc tự do sản sinh quá nhiều vượt qua khả năng chống oxi hóa nội sinh, dẫn đến quá trình oxi hóa của một loại đại phân tử sinh học, như các enzyme, protein, DNA và lipid. Stress oxi hóa là nguyên nhân quan trọng trong sự phát triển của các bệnh thoái hóa mãn tính bao gồm bệnh mạch vành tim, ung thư và lão hóa. Khả năng chống oxi hóa của flavonoid có thể được giải thích dựa vào các đặc điểm cấu trúc phân tử của chúng. Trong phân tử flavonoid có chứa các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng nhường hydro giúp chúng có thể tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ các gốc tự do. Ngoài ra, do phân tử có chứa các vòng thơm và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên hợp giúp
giúp làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động. Cao Khai được đánh giá và cho thấy có chứa lượng lớn các giá trị hoạt tính sinh học và chúng là cơ sở cho những tác dụng sinh học của Cao Khai đối với cơ thể con người trong thực tế sử dụng.
Về độc tính cấp của sản phẩm Cao Khai
Theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới, tất các các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu đều phải đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên động vật thực nghiệm trước khi đưa vào thử nghiệm trên người [68]. Sản phẩm Cao Khai có nguồn gốc từ một bài thuốc cổ phương của dân tộc Re thuộc khu vực miền Trung Việt Nam dùng làm thuốc bổ máu, thông kinh, chữa thấp khớp đau mình mẩy, lưng và đầu gối mỏi, vết tụ máu bầm tím, trừ thấp nhiệt, phù thũng, dùng cho phụ nữ sau khi sinh đẻ uống cho có nhiều sữa, máu huyết lưu thông, da dẻ hồng hào,… Theo thời gian, sản phẩm đã được sử dụng phổ biến rộng rãi không chỉ ở trong nước mà còn được lưu hành đến các quốc gia lân cận trong khu vực.
Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của sản phẩm cho thấy chuột nhắt trắng đã uống Cao Khai ở nồng độ cao tương đương 5000 mg/kg trọng thể chuột trong 24 giờ nhưng không ghi nhận trường hợp chuột chết, các chuột vẫn khỏe mạnh, lông mượt, mắt trong, ăn uống, hoạt động bình thường và không có sự xuất hiện của các triệu chứng bất thường nào trong 72 giờ sau uống thuốc lần đầu cũng như trong suốt những ngày tiếp theo sau khi dùng cao. Đại thể chuột sau 14 ngày thử nghiệm không có hiện tượng bất thường.
Khối lượng cơ thể của động vật là thông số quan trọng để nghiên cứu độc tính, các tác nhân hoặc chất độc gây ra các phản ứng trao đổi chất bất thường trong cơ thể có thể làm thay đổi khối lượng cơ thể chuột. Khối lượng cơ thể có mối tương quan chặt chẽ với lượng thức ăn tiêu thụ. Khi có độc tính, khẩu phần ăn bình thường của động vật bị ảnh hưởng gây giảm khối lượng cơ thể [69]. Thể trọng chuột của cả 2 lô đều tăng so với ngày đầu tiên của nghiên cứu. Không ghi nhận khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự gia tăng trọng lượng giữa lô sinh lý và lô dùng Cao Khai ở liều 5000 mg/kg (p>0,05). Do đó, việc
sử dụng Cao Khai không làm ảnh hưởng xấu đến đại thể chung và trọng lượng của chuột.
So với liều có hiệu quả ở thử nghiệm chống viêm, giảm đau (ở mục 3.4 và 3.5) trên chuột nhắt trắng là 400 mg/kg và 800 mg/kg trọng lượng chuột, liều 5000 mg/kg trọng lượng chuột gấp lần lượt 12,5 lần và 6,25 lần mức liều dự kiến có kết quả. Tuy nhiên, chuột vẫn khỏe mạnh, không có biểu hiện co giật, tiêu chảy hay xù lông, thở gấp, vẫn hoạt động bình thường cũng như không có chuột nào chết. Theo lý thuyết, một chất được xem là có khoảng an toàn điều trị tốt khi LD50 lớn hơn giới hạn từ 1/5 đến 1/20 của liều điều trị. Cao Khai được dùng ở liều cao gấp lần lượt 6,25 lần và 12,5 lần mức liều hiệu quả nhưng không gây chết chuột hay có sự xuất hiện triệu chứng bất thường nào trong suốt thời gian thử nghiệm. Điều này cho thấy sản phẩm Cao Khai có tính an toàn cao và được xếp vào phân loại 6 – chất gần như không có độc tính (Theo GSH - Globally Harmonised System for Classification of Chemicals) [31].
Bên cạnh đó, Cao Khai không gây ra sự khác biệt đáng kể trên chức năng tạo máu (về số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu), chức năng thận của chuột thử nghiệm. Tuy ở liều 5000 mg/kg, Cao Khai có làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme gan ALT, AST so với lô sinh lý, nhưng vẫn nằm trong ngưỡng giới hạn bình thường của chuột. Kết quả này phù hợp với báo cáo trước đó của tác giả trong nước như Nguyễn Thanh Xuân (2011) khi nghiên cứu độc tính của sản phẩm Cao Khai [44]. Song song đó, kết quả ghi nhận chỉ số Ure và Creatinine giảm so với lô sinh lý, tuy chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05) nhưng nhìn chung, việc sử dụng Cao Khai trong thử nghiệm này không làm ảnh hưởng đến chức năng thận.
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kinh nghiệm sử dụng của người dân bản địa vì cho đến nay chưa ghi nhận bất kỳ trường hợp ngộ độc nào xảy ra khi sử dụng sản phẩm Cao Khai.
Về độc tính bán trường diễn của sản phẩm Cao Khai
Trong thực tế, việc sử dụng sản phẩm Cao Khai thường phải dùng trong một thời gian dài nên để xác định được tính an toàn của bài thuốc, ngoài việc nghiên cứu độc tính cấp thì tiến hành đánh giá độc tính bán trường diễn cũng được triển khai. Theo tài liệu nghiên cứu của GS. TSKH Đỗ Trung Đàm, liều thử tác động dược lý vào khoảng 1/10 LD50 (trong giới hạn từ 1/5 tới 1/20 của LD50) [28]. Tuy nhiên, theo hướng dẫn của Cục Khoa học Công nghệ và Đào tạo (Bộ Y tế) về thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc Đông y, thuốc từ dược liệu (ban hành tại Quyết định số 141/QĐ - K2DT ngày 27/10/2015), tính toán liều tương đương giữa chuột nhắt trắng và con người được thực hiện như sau: 5000 mg/kg x 0,085 = 425 mg/kg khối lượng cơ thể người (gấp 10 lần chuột). Nếu tính cho người lớn có khối lượng khoảng 50 kg, liều có tác dụng gây độc gần đúng là: 425 mg/kg x 50 = 21,250 mg/kg (21.250 g/kg). Mức độ này lớn hơn gấp 4,5 lần so với giá trị 5000 mg/kg - được xem là liều gần như không độc đối với người (Cục Khoa học Công nghệ và Đào tạo, 2015). Bất kỳ loại dược phẩm hoặc hợp chất nào có LD50 qua đường miệng cao hơn 1000 mg/kg đều có thể được coi là an toàn và ít độc hại (Adeneye and Olagunju, 2009). Hiện nay, chưa có nghiên cứu nào công bố khả năng và các thành phần gây độc cấp tính của sản phẩm Cao Khai ở LD50 gần đúng là 5000 mg/kg.
Căn cứ vào kết quả trên, sản phẩm Cao Khai được xếp vào loại chất gần như không có độc tính – thuộc phân loại 6 theo GSH, nghiên cứu đã sử dụng liều 400 mg/kg để tiến hành đánh gia độc tính bàn trường diễn trên chuột nhắt trắng trong 12 tuần.
Ảnh hưởng của sản phẩm Cao Khai đến tình trạng chung, thể trọng của chuột và cơ quan tạo máu
Trong suốt thời gian sử dụng sản phẩm Cao Khai, chuột ở cả 2 lô (lô sinh lý và lô sử dụng Cao Khai ở liều 400 mg/kg thể trọng chuột) đều hoạt động bình thường, mắt sáng, nhanh nhẹn, ông mượt, ăn uống tốt, phân khô ráo và không ghi nhận bất kỳ biểu hiện khác thường nào ở cả 2 lô trong suốt thời gian nghiên cứu.
Trọng lượng chuột ở cả 2 lô nghiên cứu đều tăng có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với trước nghiên cứu. Không ghi nhận sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự gia tăng trọng lượng giữa lô sinh lý và lô sử dụng Cao Khai ở liều 400 mg/kg thể trọng chuột (Bảng 3.13). Như vậy, kết quả cho thấy việc sử dụng Cao Khai không làm ảnh hưởng xấu đến tình trạng chung và thể trọng chuột.
Đánh giá các chỉ tiêu huyết học là chỉ số tốt về tình trạng sinh lý, bệnh lý ở người cũng như các động vật khác. Xác định các thông số huyết học sẽ giúp đánh giá mức độ ảnh hưởng độc tính của dược liệu [70]. Các thông số huyết học cung cấp thông tin quan trọng những biến đổi bất thường trong quá trình trao đổi chất của cơ thể và phản ứng của cơ thể khi bị chấn thương hoặc tổn thương, thiếu chất và căng thẳng [71]. Các thông số huyết học chủ yếu được xác định là bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu thể hiện qua các giá trị WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT. Số lượng và chất lượng các tế bào máu phản ánh tình trạng của cơ quan tạo máu [50]. Chức năng chính của bạch cầu WBC là thực bào và sản xuất gamma globulin, trong chuột khỏe mạnh có khoảng 3-14x109/µL. WBC biến đổi là do viêm nhiễm, bệnh máu ác tính, các bệnh bạch cầu và ngược lại giảm do suy tủy, thiếu vitamin B12, nhiễm khuẩn. Thông số bạch cầu WBC của chuột thí nghiệm uống Cao Khai sau 90 ngày có sự khác biệt so với chuột bình thường thể hiện mức nghĩa thống kê (p<0,05). Tuy nhiên vẫn nằm trong khoảng chỉ số sinh lý bình thường của chuột [19].
Tiếp đó, hồng cầu RBC có chức năng quan trọng nhất là vận chuyển oxi đến các cơ quan của cơ thể và lấy CO2 đi, trong chuột khỏe mạnh RBC trong khoảng 5 – 9,5x1012L. Số lượng hồng cầu giảm hay còn gọi là thiếu máu xảy ra sau khi mất máu, tan máu qua miễn dịch trung gian, bệnh viêm, bệnh thận, thiếu sắt, rối loạn sinh tủy, rối loạn di truyền và tạo khối u. Huyết sắc tố hemoglobin HgB trong hồng cầu có nhiệm vụ tiếp nhận oxi qua phổi và nhường lại oxi đó cho các tế bào khi qua các mao mạch và chiếm từ 10 - 17 g/dL ở chuột khỏe mạnh. Định lượng HGB để biết khả năng vận chuyển oxi của hồng cầu. Huyết cầu trong máu hematocrit HCT cũng phản ánh một phần tình trạng của hồng
so với hầu hết các loài động vật có vú khác, thể tích trung bình của một hồng cầu MCV trong khoảng từ 48 - 56 fL khi khỏe mạnh. Lượng hemoglobin trung bình MCH từ 11 – 19 pg, chỉ số này cũng rất quan trọng, thay đổi tỷ lệ thuận với MCV. MCHC của chuột bình thường là 25 - 35 g/dL. Tiểu cầu PLT tham gia vào cơ chế đông máu và trong chuột khỏe mạnh. Số lượng tiểu cầu tăng có thể do viêm, bệnh tăng sinh tủy xương, tạo khối và thiếu sắt. Ngược lại, tiểu cầu giảm cũng có thể do bệnh tăng sinh tủy xương, sự tiết hormon do tế bào thần thải ra [41, 72, 73]. Kết quả cho thấy các thông số hồng cầu, tiểu cầu như RBC, MCV, MCH của chuột thí nghiệm sử dụng Cao Khai ở liều 400 mg/kg khối lượng chuột có sự khác biệt ở mức ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với chuột bình thường nhưng các giá trị này tăng không đáng kể, vẫn nằm trong khoảng sinh lý phù hợp. Bởi vì, các thông số huyết học của chuột có thể thay đổi tùy thuộc vào giống loài, đàn chuột, giới tính, điều kiện môi trường, thức ăn, phương pháp thí nghiệm [72] và phù hợp với giá trị tham chiếu [73]. Hệ thống tạo máu rất nhạy cảm với các chất độc hại, có thể bị thay đổi khi ăn phải những cây có chứa các chất gây độc [74].
Những thay đổi của các thông số huyết học có thể phản ánh những ảnh hưởng xấu đến các chức năng của xương tủy, thiếu máu, mất máu [75]. Từ những phân tích trên, sản phẩm Cao Khai không gây ra bất kỳ thay đổi xấu đến các thông số huyết học trên chuột thí nghiệm ở liều uống 400 mg/kg khối lượng chuột.
Ảnh hưởng của sản phẩm Cao Khai đến chức năng gan thận
Các thông số hóa sinh máu rất nhiều nhưng thông số phản ánh chức năng gan thường được nghiên cứu là các transaminase như AST, ALT. Các thông số phản ánh chức năng thận thường nghiên cứu là creatinin và urea huyết thanh [41]. Gan là cơ quan đảm nhận nhiều nhiệm vụ quan trọng trong cơ thể, trong đó có nhiệm vụ chuyển hóa các chất, tiếp xúc với các chất bên ngoài được hấp thụ trong ruột và chuyển hóa thành các hợp chất khác có thể hoặc không thể gây tổn thương cho gan của chuột [76]. Sự phân bố của hai loại enzyme AST và ALT trong tế bào gan khác nhau. AST nằm trong bào tương và ti thể ở nhiều