400 và 800mg/kg
2.3.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
Nguyên tắc là nhằm chiết tách hỗn hợp các chất có trong nguyên liệu thành 3 phân đoạn theo độ phân cực tăng dần (kém phân cực, phân cực trung bình, phân cực mạnh) với các dung môi diethyl ether, ethanol, nước; và xác định các nhóm hợp chất trong dung dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng.
Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng theo phương pháp của Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh (2016) được cải tiến và sửa đổi từ quy trình phân tích của I. Ciuley (Đại học Dược Bucharest, Rumani). Quy trình chiết dịch phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật được thực hiện theo Hình 2.2.
Hình 2.1. Quy trình chiết dịch phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật Cao dược liệu sẽ được hòa với dung môi tương ứng với tỉ lệ là 1:20 (g/ml) và tiến hành các phản ứng xác định thành phần hóa học.
Dịch diethyl ether được dùng để xác định các nhóm hợp chất sau: alkaloid, anthraquinon, carotenoid, chất béo, coumarin, flavonoid, tinh dầu, triterpenoid (Hình 2.3).
Hình 2.2. Xác định các chất tan trong dịch chiết diethyl ether Dịch cồn được dùng để xác định các nhóm hợp chất sau: alkaloid, coumarin, flavonoid pyron, flavonoid proanthocyanidin, flavonoid anthocyanin, glycoside tim, tanin, saponin, hợp chất khử, acid hữu cơ (Hình 2.4).
Hình 2.3. Xác định các chất tan trong dịch chiết cồn
Dịch nước được dùng để xác định các nhóm hợp chất sau: acid hữu cơ, alkaloid, glycosid tim, flavonoid pyron, flavonoid proanthocyanidin, flavonoid anthocyanin, hợp chất khử, polyphenol, polyuronic, saponin và tannin (Hình 2.5).
Hình 2.4. Xác định các chất tan trong dịch chiết nước
2.3.3. Đánh giá hàm lượng một số hoạt chất chính Hàm lượng saponin tổng
Cân chính xác khoảng 5g cao, hòa tan trong khoảng 100ml nước cất. Lọc qua giấy lọc. Lắc loại tạp với ether dầu hỏa. Dịch chiết thu được lắc nhiều lần với n-BuOH đến kiệt saponin. Gộp các dịch chiết n-BuOH, đem cất thu hồi dung môi. Cắn chứa saponin toàn phần hòa tan vào lượng nhỏ EtOH 80%, sau
thấy xuất hiện tủa. Lọc lấy tủa, dịch lọc tiếp tục thêm aceton để kết tủa hết saponin. Lọc lấy tủa, sấy đến khối lượng không đổi ở 80°C, cân và tính kết quả.
Hàm lượng saponin toàn phần (X %) được tính theo công thức sau:
𝑋 (%) = 𝑎 × 100
𝑚 × (100 − 𝑑)× 100
Trong đó:
a: khối lượng cắn saponin thu được (g) d: độ ẩm của cao (%)
m: khối lượng dược liệu đã dùng
Hàm lượng polyphenol tổng
Tiến hành pha loãng dung dịch với nồng độ phù hợp (dịch thu được ở phần chiết mẫu). Sau đó, hút 0,5ml dung dịch mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm. Thêm vào 2,5ml dung dịch Folin-Ciocalteu 10% và đồng nhất bằng máy Vortex, để dung dịch phản ứng trong 5 phút. Tiếp tục, thêm 2,0ml dung dịch Na2CO3 7,5% và lắc đều. Để dung dịch ở nhiệt độ phòng trong bóng tối 1 giờ. Sau đó đo độ hấp thu quang học ở bước sóng 765nm trên máy quang phổ UV-Vis. Gallic acid được dùng làm chất chuẩn. Hàm lượng polyphenol được biểu diễn theo microgam đương lượng acid gallic trong 1 mg cao chiết (µgGAE/mg cao chiết) [45].
Hàm lượng flavonoid tổng
Tiến hành pha loãng dung dịch với nồng độ phù hợp (dịch thu được ở phần chiết mẫu). Hút 0,5ml dung dịch mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm, sau đó thêm vào 0,1 ml dung dịch AlCl3 10%. Tiếp tục thêm vào 0,1 ml dung dịch CH3COOK 1M và 4,3ml nước cất, lắc đều. Để dung dịch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó đo độ hấp thu quang học ở bước sóng 415nm trên máy quang phổ UV-Vis. Quercetin được dùng làm chất chuẩn. Hàm lượng flavonoid tổng được biểu diễn theo microgam đương lượng quercetin trong 1 mg cao chiết (µgQE/mg cao chiết).
Hàm lượng triterpensaponin:
Xây dựng đường chuẩn của axit oleanolic:
Dung dịch axit oleanolic pha với nồng độ 2,5 mg/ml, được cho vào các ống nghiệm với các thể tích khác nhau, sau đó 0,2 ml vanillin-axit acetic (5%), 1,2 ml axit percholoric (HClO4), đun cách thủy và ủ ở 70oC trong 15 phút. Các ống được lấy ra và làm mát dưới vòi nước trong 2 phút, sau đó, ethyl acetate được thêm vào sao cho tổng thể tích là 5 ml. Đo độ hấp thu ở bước sóng 550 nm.
Xác định hàm lượng triterpensaponin trong mẫu:
Mẫu sau khi trích ly được lọc, hút chính xác 0,2 ml dịch trích sau ly tâm cho vào ống nghiệm, tiến hành các thao tác như trên. Hàm lượng triterpensaponin được phân tích dựa trên phương pháp quang phổ so màu, đo độ hấp thu quang học ở bước sóng 550 nm.
Hàm lượng triterpensaponin % (g/g chất khô) được tính tính theo công thức sau:
Trong đó:
Cx là nồng độ triterpensaponin (mg/ml); m là khối lượng mẫu (g);
h là độ ẩm nguyên liệu (%); V là thể tích dịch sau ly tâm (ml).
Hiệu suất trích ly saponin triterpenoid trong dịch trích được tính theo công thức:
Hiệu suất trích ly (%) = Hàm lượng triterpensaponin trong dịch
Hàm lượng anthranoid toàn phần
Cân chính xác 2g cao thuốc, đun cách thủy trong bình có ống sinh hàn hồi lưu trong 2 giờ rưỡi với 200 ml CHCl3 và 50 ml H2SO4 25%. Sau đó lắc các dịch chiết CHCl3 với 50 ml dung dịch natri bisulfit 10% trong 5 phút. Sau khi để yên tách lớp CHCl3, lọc và lắc với dung dịch acid hydrochloric 1% trong 5 phút. Sau khi 2 lớp phân cách rõ ràng, tách lớp dưới, lọc và bốc hơi CHCl3, sấy, lúc đầu 60oC rồi sau đó 80oC đến khi khối lượng không đổi [46].
Hàm lượng anthraquinon toàn phần (X %) được tính theo công thức sau:
𝑋 (%) = 𝑎 × 100
𝑚 × (100 − 𝑑)× 100
Trong đó:
a: khối lượng cắn anthraquinon thu được (g) d: độ ẩm của cao (%)
m: khối lượng dược liệu đã dùng
2.3.4. Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa
Phương pháp khử gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
Pha loãng mẫu cao đến khoảng nồng độ phù hợp, hút 0,5ml cao chiết mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm. Mẫu đối chứng thay cao chiết ethanol (99,5%). Sau đó, hút thêm vào ống nghiệm 1,5ml dung dịch DPPH (OD517 nm = 1,1 ± 0,02) vào ống nghiệm và để trong bóng tối trong 30 phút. Đo độ hấp thụ quang học ở 517nm trên máy quang phổ UV-Vis. Vitamin C (acid ascorbic) được sử dụng làm chất chuẩn để so sánh.
Hoạt tính khử gốc tự do DPPH (IC %) được xác định dựa theo công thức:
IC (%) =AbsC − AbsT
AbsC × 100
Trong đó:
AbsT: Độ hấp thụ quang của mẫu thử
Kết quả được ghi nhận dựa trên giá trị IC50, là nồng độ mà tại đó mẫu thử khử được 50% gốc tự do DPPH.
Phương pháp khử gốc tự do ABTS (2,2'-azino-bis)
Dung dịch gốc tự do ABTS● được chuẩn bị bằng cách cho 10ml dung dịch ABTS nồng độ 7,4 mM vào 10ml dung dịch K2S2O8 nồng độ 2,6 mM rồi ủ trong bóng tối trong 24 h, sau đó pha loãng bằng ethanol rồi điều chỉnh độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734 nm đến 1,1 ± 0,02. Pha loãng cao chiết mẫu đến khoảng nồng độ phù hợp, hút 0,5ml cao chiết mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm. Mẫu đối chứng thay cao chiết ethanol (99,5%). Sau đó, hút thêm vào ống nghiệm 1,5ml dung dịch ABTS (OD517 nm = 1,1 ± 0,02) vào ống nghiệm và để trong bóng tối trong 30 phút. Đo độ hấp thụ quang học ở 734nm trên máy quang phổ UV-Vis. Vitamin C (acid ascorbic) được sử dụng làm chất chuẩn để so sánh.
Hoạt tính khử gốc tự do ABTS (IC %) được xác định dựa theo công thức:
IC (%) =AbsC − AbsT
AbsC × 100
Trong đó:
AbsC: Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng AbsT: Độ hấp thụ quang của mẫu thử
Kết quả được ghi nhận dựa trên giá trị IC50, là nồng độ mà tại đó mẫu thử khử được 50% gốc tự do ABTS.
2.3.5. Đánh giá xác định tính an toàn về hàm lượng kim loại nặng và vi sinh vật của cao Khai
a. Hàm lượng kim loại nặng có trong mẫu cao Khai được phân tích và đánh giá theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVNII:2012, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc.
Phương pháp thử giới hạn nhiễm khuẩn: Theo tiêu chuẩn DĐVN V, phụ lục 13.6 (trang PL-300). Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm, mốc có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trong thuốc. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn. Tiến hành chuẩn bị mẫu, nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, đếm tổng số vi sinh vật, vi nấm sau thời gian nhất định.
2.3.6. Đánh giá độc tính của sản phẩm cao Khai
2.3.6.1. Khảo sát độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng
Nguyên tắc: Nghiên cứu độc tính cấp của mẫu thử trên động vật thí nghiệm, chủ yếu là xác định liều chết trung bình nếu có (liều làm chết 50% số con vật thí nghiệm = LD50, lethal dose 50%) trong những điều kiện nhất định. Biết LD50 mới xác định được chỉ số điều trị TI là một thông số rất quan trọng để quyết định liều điều trị, thường là khoảng 1/10 LD50 hoặc nhỏ hơn [30].
Thực hiện:
Mẫu thử: Cao chiết từ bài thuốc gia truyền cao khai sản xuất tại Ninh Thuận.
Đối tượng: Chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino, 6-8 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 22 ± 2 g, được cung cấp bởi Viện vaccin và sinh phẩm y tế Nha Trang.
Tiến hành: Thí nghiệm khảo sát độc tính cấp của cao chiết được tiến hành theo phương pháp của Kandimalla et al. (2016) có hiệu chỉnh [47]. Cho chuột nhịn đói ít nhất 12 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm. Chuột được chia ngẫu nhiên thành 2 lô, mỗi lô gồm 6 chuột. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Lô 1: Chuột bình thường uống nước cất (đối chứng sinh lý)
Lô 2: Chuột bình thường uống cao khai liều 5000 mg/kg trọng lượng chuột.
Chuột uống nước cất/ cao khai với thể tích tối đa 50 ml/kg trọng lượng chuột theo “Hướng dẫn thử nghiệm phi lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y,
thuốc từ dược liệu” của Bộ Y tế ban hành theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27 tháng 10 năm 2015 [30].
Theo dõi và ghi nhận cử động tổng quát, biểu hiện về hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tỷ lệ tử vong của chuột trong vòng 14 ngày [30]. Sau 14 ngày, tất cả chuột thử nghiệm được gây mê bằng CO2, lấy máu tim để xét nghiệm công thức máu và một số chỉ số sinh hóa.
Chỉ tiêu phân tích: Tỉ lệ chuột chết, trọng lượng chuột, sinh hóa như urê, creatinin, AST (SGOT), ALT (SGPT), công thức máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu).
2.3.6.2. Khảo sát độc tính bán trường diễn trên đường uống của chuột nhắt trắng nhắt trắng
Thí nghiệm khảo sát độc tính bán trường diễn của cao chiết được tiến hành theo phương pháp của Kandimalla et al. (2016) có hiệu chỉnh [47].
Các cao chiết được thử nghiệm ở liều 400 mg/kg khối lượng chuột liện tục trong 90 ngày. Sau đó, chuột được rút máu ở tim để xét nghiệm công thức máu và một số chỉ tiêu sinh hóa. Chuột khỏe mạnh sau khi cân trọng lượng được chọn ngẫu nhiên và chia thành 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 6 con chuột. Các nghiệm thức được bố trí như sau:
Nghiệm thức 1: Chuột bình thường uống nước cất (đối chứng sinh lý). Nghiệm thức 2: Chuột bình thường uống cao chiết liều 400 mg/kg pha trong DMSO 1%.
Chỉ tiêu phân tích: Tỉ lệ chuột chết, trọng lượng chuột, sinh hóa như urê, creatinin, AST (SGOT), ALT (SGPT), công thức máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu).
2.3.7. Khảo sát tác động kháng viêm cấp trên mô hình gây viêm bàn chân chuột bằng carrageenan
và β-(1,4)-3,6-hydroD-galactose. Do là hợp chất cao phân tử nên khi vào trong cơ thể, carrageenan trở thành kháng nguyên thông qua cơ chế miễn dịch kháng nguyên - kháng thể. Mức độ viêm tối đa ở trong thời gian 3-5 giờ. Mẫu có tác dụng kháng viêm sẽ làm giảm mức độ phù chân chuột. Carragenan gây viêm cấp theo 2 pha: pha 1 giải phóng histamine, serotonin; pha 2 giải phóng bradykinin, protease, prostaglandin, lysosom [48].
Thực hiện:
Mẫu thử: Cao Khai sản xuất tại Ninh Thuận
Chuẩn bị dung dịch chống thấm: 250mg NaCl trong 500ml nước cất + 1ml dung dịch chống thấm.
Chuẩn bị dung dịch gây viêm: ngâm carrageenan 1% trong NaCl 0,9% trước 3 giờ cho trương nở hoàn toàn.
Đầu tiên, tất cả chuột được đo thể tích chân chuột bình thường (V0) trên máy Plethysmometer. Nhúng chân phải của chuột vào dung dịch chống thấm đến khuỷu chân, nhấn giữ bàn đạp để cố định, ghi nhận thể tích trên máy, tiến hành đo 3 lần và lấy kết quả trung bình. Sau đó, chuột được phân lô ngẫu nhiên thành 5 lô sao cho V0 khác biệt không có ý nghĩa thống kê (8 chuột/lô)
Lô 1 (sinh lý): cho chuột uống nước cất Lô 2 (chứng bệnh): cho chuột uống nước cất
Lô 3 (đối chứng): cho chuột uống thuốc diclofenac liều 5 mg/kg.
Lô 4 (Cao khai 1): cho chuột uống cao khai liều D1 (căn cứ theo kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống hoặc liều dùng trên người).
Lô 5 (Cao khai 2): cho chuột uống cao khai liều D2 (căn cứ theo kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống hoặc liều dùng trên người).
Chuột được nhịn đói 12 giờ và cho uống nước cất hoặc diclofenac hoặc cao thử với thể tích 10 ml/kg trọng lượng chuột. Sau khi uống nước cất, diclofenac và mẫu thử 1 giờ, chuột ở các lô từ 2 đến 5 được tiêm 0,025 ml dịch treo carrageenan 1% vào gan bàn chân phải sau để gây viêm bàn chân; chuột lô sinh lý được tiêm dung dịch NaCl 0,9%. Sau đó, tất cả chuột được cho vào lồng
có giá đỡ để tránh nhiễm trùng chân. Đo thể tích bàn chân chuột lần lượt sau 1, 3, 5, 24, 48, 72, 96, 120, 144 giờ (Vt) sau khi gây viêm.
Mức độ phù bàn chân chuột X (%) được tính theo công thức X (%) = (Vt-V0)/V0 x 100
Trong đó :
Vt: thể tích chân chuột tại thời điểm t sau khi gây viêm (ml) Vo: thể tích chân chuột tại thời điểm trước khi gây viêm (ml)
Sau khi đo thể tích bàn chân ở thời điểm 24, 48, 72, 96, 120 và 144 giờ, chuột được cho uống nước cất, diclofenac hoặc mẫu thử 01 lần/ngày.
Các lô cao khai và lô đối chứng được khảo sát về hiệu quả kháng viêm tương đối thông qua khả năng giảm độ phù bàn chân chuột I (%) được tính theo công thức:
I (%) = (X1-X2) / (X1-X3) * 100% Trong đó:
X1: độ phù chân chuột của lô chứng bệnh
X2: độ phù chân chuột của lô cao khai hoặc độ phù chân của lô đối chứng. X3: độ phù chân chuột của lô sinh lý.
2.3.8. Đánh giá tác dụng giảm đau của sản phẩm Cao Khai
2.3.8.1 Khảo sát tác động giảm ngoại biên bằng phương pháp gây đau quặn bằng acid acetic quặn bằng acid acetic
Trước khi khảo sát tác động giảm đau của Cao Khai, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát độc tính cấp nhằm tạo cơ sở để chọn liều cho thử nghiệm. Chuột nhịn đói ít nhất 12 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm, chia ngẫu nhiên thành 2 lô, mỗi lô gồm 6 chuột. Lô đối chứng sinh lý uống nuốc cất, lô thử
lệ tử vong của chuột trong vòng 14 ngày [49, 50]. Kết quả cho thấy sau khi uống Cao Khai với liều 5000 mg/kg, chuột không có biểu hiện bất thường, tỷ lệ sống sau 14 ngày là 100%. Cao Khai không gây ra tính cấp cho chuột thí nghiệm ở liều 5000 mg/kg trọng lượng chuột chứng tỏ giá trị LD50sẽ cao hơn liều này. Liều cho tác động dược lý thường trong khoảng 1/20 tới 1/5 của LD50 [50]. Từ đó, đề tài sử dụng liều 400 mg/kg và 800 mg/kg để tiến hành thử nghiệm khảo sát tác dụng giảm đau của cao thuốc.
Đề tài lựa chọn diclofenac, một thuốc thuộc nhóm NSAID, với liều 5 mg/kg sử dụng làm thuốc đối chứng trong thử nghiệm giảm đau ngoại biên [51].
Chia chuột ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô gồm 8 con. Điều kiện cho uống là 0,1 ml/10g thể trọng chuột. Lô chứng bệnh (CB): Uống nước cất.
Lô chứng dương (CD): Uống diclofenac với liều 5mg/kg.
Lô thử nghiệm 1 (CK400): Uống Cao Khai với liều 400 mg/kg thể trọng chuột.
Lô thử nghiệm 1 (CK800): Uống Cao Khai với liều 800 mg/kg thể trọng chuột.
Sau khi dùng thuốc 60 phút, tất cả các chuột được gây đau bằng cách tiêm phúc mô dung dịch acid acetic 1% pha trong nước muối sinh lý. Mỗi chuột