CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.3. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ hai lần HPLC-MS/MS
1.3.2. Nguồn ion hóa và bộ phận phân tích khối phổ
1.3.2.1. Bộ phận phân tích khối phổ
Máy phân tích kh i ph hay chính xác hố ổ ơn máy phân tích “tỉ ệ khố ượ l i l ng theo đ ệi n tích (m/z) của ion “ là thiế ịt b phân tích d a trên s chuy n ng c a các ion trong ự ự ể độ ủ môi trường chân không ‘’[14].
Các máy phân tích kh i ph ố ổ thường được phân lo i tu vào vi c tách các ion mang ạ ỳ ệ đ ệi n theo phương pháp nào. ây ta ch xét thi t b thông d ng là kh i ph t c c ( Ở đ ỉ ế ị ụ ố ổ ứ ự quadrupole mass spectrometer ). Để rõ c i m c a LC MS/MS ( 2 l n kh i ph ) ta đặ đ ể ủ – ầ ố ổ xét thiết bị LC- MS ( một lần kh i ph ) tr c ố ổ ướ
22
Hình 1.15: Mô hình thiết bị khối phổ MS ( LC-MS )
Phần quan tr ng nh t là b l c t c c (quadrupole mass spectrometer). S ion hoá ọ ấ ộ ọ ứ ự ự m u x y ra t i ngu n ion hoá. Các ion ẫ ả ạ ồ được phân tách b i b t c c Q1 tr c khi tở ộ ứ ự ướ ới detector [15].
Hình 1.16: Cấu tạo và hoạt động bộ tứ cực Trong đó :
- Source : Ngu n ion hóa ồ
- Resonant ion : ion cộng hưởng (ion được lựa ch n) ọ - Nonresonnant ion : ion bị loại bỏ
23
- DC and AC voltages : Nguồn điện m t chi u và xoay chi u áp lên b t c c ộ ề ề ộ ứ ự
B t c c g m 2 c p thanh hình tr ộ ứ ự ồ ặ ụ được đặt song song v i nhau m t cách chính xác ớ ộ hai đầu đặt lên giá đỡ. T ng cừ ặp thanh đối di n ệ được n i i n v i nhau. i n xoay chi u ố đ ệ ớ Đ ệ ề áp lên c 4 thanh nh ng thanh g n c c âm i di n 180ả ư ắ ự đố ệ o v i thanh g n c c d ng. Các ớ ắ ự ươ thanh mang i n + hay - ph đ ệ ụ thuộc giá tr i n th m t chi u áp lên. M i c p thanh ị đ ệ ế ộ ề ỗ ặ đối di n nhau ch u tác d ng dòng i n có t n s r t l n 10ệ ị ụ đ ệ ầ ố ấ ớ 8 Hz và chi u i n áp trên mề đ ệ ỗi thanh cũng thay đổi tương ng. Do ứ ảnh hưởng lực điệ ừn t trư ng các ion v a di chuy n ờ ừ ể trong không gian n m gi a các thanh tr v a dao ng quanh tr c tâm. Nh v y v i mằ ữ ụ ừ độ ụ ư ậ ớ ỗi giá tr i n áp ị đ ệ được áp lên thì chỉ có nh ng ion có t s m/z thích h p mữ ỷ ố ợ ới đi qua b t ộ ứ c c t i detecter. Khi ta ch n mự ớ ọ ảnh m/z đặc trưng cho chất được nghiên c u thì ph n mứ ầ ềm chuyể ỷ ốn t s này thành s ự thay đổ ầi t n số và điện th áp lên b t c c đ ion quan tâm có ế ộ ứ ự ể được dao đ ng c ng hộ ộ ưởng để di chuy n qua t c c và t i b ph n ghi nh n tín hi u[34]. ể ứ ự ớ ộ ậ ậ ệ Kỹ thuật MS m t l n có m t s nhộ ầ ộ ố ược đ ểi m nh : không nghiên c u ư ứ được c ơ chế phân m nh, s khác bi t gi a các ng phân, xác nh thêm chi ti t c u trúc hoá h c, chả ự ệ ữ đồ đị ế ấ ọ ịu ảnh hưởng rõ r t n n m u ch t phân tích, do k thu t ion hoá êm d u nên kh i ph ch cho ệ ề ẫ ấ ỹ ậ ị ố ổ đồ ỉ thấy ion phân tử… [26].
K ỹ thuật MS/MS (2 l n) kh c phầ ắ ục được nh ng i m này ng th i t ng thêm ữ đ ể đồ ờ ă độ nh y (c ạ ỡ fentogram ), tăng độ chính xác k t qu ế ả loại ỏ ảnh hưởb ng của nền m u. ẫ
Máy kh i ph ố ổ MS – MS hay máy o kh i ph hai l n liên ti p g m hai h máy đ ố ổ ầ ế ồ ệ kh i ph riêng biố ổ ệt độc l p nhau ậ được n i li n v i nhau cách nhau b i m t bu ng va ố ề ớ ở ộ ồ chạm (collision cell). MS đầu tiên (t c c Q1) ứ ự được s d ng ử ụ để cô l p ion ậ sơ cấp (precursor ion), ion này liền ngay sau ó s b phân m nh t i bu ng va ch m collision đ ẽ ị ả ạ ồ ạ cell để cho ra nh ng ion th c p (product ion) ti p theo MS th hai (t c c Q2) s phân ữ ứ ấ ế ứ ứ ự ẽ tách nh ng ion này. Nh ng ion mong mu n s i t i detector và chuy n thành tín hiữ ữ ố ẽ đ ớ ể ệu [15,16].
24
Hình 1.17: Mô hình thiết bị khối phổ MS/MS Trong đó :
- Rough pump : bơm chân không sơ cấp hút lo i b các ch t không dạ ỏ ấ ở ạng ion như dung môi, các c u t b n không b ấ ử ề ị ion hóa…
- Turbo pump : bơm chân không thứ ấ c p tạo môi trường chân không sâu 2,7– 3,3.10-5 torr nhằm tránh s phân m nh ion do va ch m ự ả ạ
- Collision cell : Nơi các ion bị phân m nh do va chả ạm với khí N2 99.999% 1.3.2.2. Các nguồn ion hóa
Việc ghép s c ký l ng LC vào máy kh i ph MS không th th c hi n tr c ti p ắ ỏ ố ổ ể ự ệ ự ế được, vì mu n o kh i ph c n ph i t o ra các ion th khí, trong khi s c ký l ng ố đ ố ổ ầ ả ạ ở ể ắ ỏ được áp d ng cho các ch t ít bay h i. V n còn ph c t p thêm vi c khi h p chụ ấ ơ ấ đề ứ ạ ở ệ ợ ất đi ra khỏi c t s c ký l ng, h p chộ ắ ỏ ợ ất đ đang ởó trong pha ng l ng, c n ph i lo i b dung môi trđộ ỏ ầ ả ạ ỏ ước khi đưa hợp chất khảo sát vào MS.
Những s không tươự ng thích cơ bản gi a hai lo i k thu t này là :ữ ạ ỹ ậ
- Máy kh i ph MS hoố ổ ạt động trong i u ki n chân không sâu, nhiđ ề ệ ệt độ cao, các chất khảo sát ph ở ểải th khí, v n t c dòng ch y nhậ ố ả ỏ….
- Máy s c ký l ng LC ho t ng trong i u ki n : áp su t cao, nhiắ ỏ ạ độ đ ề ệ ấ ệt độ ươ t ng đối thấp, các ch t kh o sát ể ỏấ ả ởth l ng, v n t c dòng ch y l n… ậ ố ả ớ
25
Để kh c nh ng khó kh n trong vi c ghép HPLC và MS c n ph i có k t n i chuyắ ữ ă ệ ầ ả ế ố ển đổi trung gian và kèm theo là các kiểu ion hoá ESI, APCI [16,26].
1.3.2.2.1. Chế độ ion hóa đầu phun điện tử (ESI)
Đầu phun điệ ửn t (Electrospray Ionization: ESI) có c u tấ ạo như hình 1.18 [15].
Hình 1.18: Cấu tạo đầu phun ESI Trong đó :
- Nebulizing gas : Khí N2 (>99,5%) nén áp suở ất 60 psi được tr n h p v i dung ộ ợ ớ môi pha động c a HPLC t o dủ ạ ạng sương mù.
- Heated nitrogen drying gas : Khí N2 (>99,5%) được gia nhi t 330ệ oC tốc độ 5 lit/phút thổi khô, hóa hơi toàn bộ sương mù.
- Capilary : ng mao quỐ ản được áp th ế 2,5 kV để hút các ion phân t . Ph thuử ụ ộc d ng ion phân t là positive/negative mà chiạ ử ều điện trường có chiều ngược lại.
Trong k thu t ESI, s c ký lỹ ậ ắ ỏng được n i vố ới ống mao qu n làm b ng thép không ả ằ gỉ, pha động (dung môi pha ng có thêm chđộ ất đ ệi n ly ) k t hế ợp khí nén nitơ áp suất cao (60 psi) được phun s ng mù ra khươ ỏi ống mao qu n vào vùng có i n tr ng m nh (3-6 ả đ ệ ườ ạ kV) nhiở ệt độ cao (trên 300oC).
Do ảnh h ng c a nhi t độưở ủ ệ dung môi hoá h i hoàn toàn và i n th cao h n h p ơ đ ệ ế ỗ ợ chấ ầt c n phân tích chuy n thành ion phân t và b hút vào MS (Q1). Có 2 ch b n phá: ể ử ị ế độ ắ b n phá vắ ới chế độ ion dương (ESI+) và ion âm (ESI- ).
ESI là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao. Đây cũng là nguồn ion hóa mà đề tài lựa chọn để phân tích HCBVTV
26
1.3.2.2.2. Chế độ ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)
Ion hoá hoá học ở áp su t khí quy n (Atmospheric Pressure Chemical Ionization : ấ ể APCI) hoạt động theo nguyên t c sau: Ho t ch t c n phân tích trong pha ng sau khi qua ắ ạ ấ ầ độ kh i c t s c ký HPLC, qua ng mao qu n k t h p khí tr áp su t cao (60psi). Khi ra ỏ ộ ắ ố ả ế ợ ơ ở ấ khỏi ống mao qu n pha ng chuy n thành d ng s ng mù. Các h t s ng nh ả độ ể ạ ươ ạ ươ ỏ được khí gas nhiở ệt độ cao hoá hoàn toàn thành th khí. áp su t khí quy n, tể Ở ấ ể ại đầu que phóng đ ện Corona (đặt điệi n áp r t l n 3- 6 kV) tấ ớ ập chung điện trường r t m nh các c u t x y ấ ạ ấ ử ả ra sự ion hoá hoá h c (hình 1.19)[15]. ọ
Hình 1.19: Vùng phản ứng của chế độ ion hóa APCI
Tại đây có s ự trao đổi proton thành ion d ng ( M+H )để ươ + và trao i electron đổ ho c proton bi n thanh ion âm (M-ặ để ế H)-. . Do i n áp cao 2500 V các ion đ ệ được hút vào capillary và đi tớ ội b ph n phân tich kh i ph ậ ố ổ [15,16].
V i dòng máy Agilent 6410 Triple Quad LC-MS/MS h ớ ỗ trợ ả c hai d ng ion hoá ạ ESI và APCI trên cùng một nguồn ion hoá .
V i nguớ ồn ion hóa đa chế độ thì c 2 ch ả ế độ ion hóa ESI và APCI đều được xây dựng. Điều này r t thu n ti n vì các ho t ch t khác nhau phù h p v i t ng ki u ion hóa ấ ậ ệ ạ ấ ợ ớ ừ ể mà không cần thay đổi ngu n ion hóa. Tuy nhiên quá trình b o trì, v sinh làm s ch tr ồ ả ệ ạ ở nên phức tạp và độ nh y thiậ ết bị giảm xuống so với từng ngu n ion hóa riêng bi t ồ ệ
1.4. Phương pháp QuEChERS phân tích đa dư lượng thuốc BVTV
Năm 2003, Anastassiades và c ng s [19, 20] gi i thi u mộ ự ớ ệ ột phương pháp mới để phân tích dư lượng HCBVTV, sau này được gọi là phương pháp QuEChERS (viế ắ ủt t t c a
27
quick nhanh, easy d , cheap r , effective hi u qu , rugged - – – ễ – ẻ – ệ ả ổn định và safe – an toàn). QuEChERS là một phương pháp phân tích đa dư lượng thu c tr sâu trong nhiố ừ ều loạ ềi n n m u khác nhau, ch c n có kho ng 70 ẫ ỉ ầ ả – 100% nước trong thành ph n (m u khô ầ ẫ được cho thêm nước). Như tên gọ ủi c a nó, chu n b m u theo QuEChERS có nhi u thu n ẩ ị ẫ ề ậ l i so vợ ới các phương pháp truy n th ng khác mà về ố ẫn đảm b o k t qu ả ế ả phân tích. Phương pháp QuEChERS ban đầu được báo cáo đầu tiên năm 2002 tại h i ngh ộ ị phân tích dư lượng Châu Âu b i Anastassisdes, Lehotay và c ng sở ộ ự. Năm 2003, Lehotay và các ộ c ng s [34] nghiên c u thự ứ ẩm đị h phương pháp này cho thấy phương pháp này cho kến t qu tả ốt v i 207 ch t trong s 235 thu c tr sâu trên các n n m u rau xà lách, nho và cam; tuy ớ ấ ố ố ừ ề ẫ nhiên nh ng ch t nh y v i pH b ữ ấ ạ ớ ị ảnh hưởng rõ rệt. Sau đó Lehotay và cộng s 4] thay ự [3 đổi phương pháp gốc b ng cách s dằ ử ụng đệm acetat pH 4,8-5,0 để tăng độ thu h i c a ồ ủ thuốc tr ừ sâu. Phương pháp này sau đó đã được nghiên c u thí nghi m liên phòng trong ứ ệ 13 phòng thí nghiệm ở 7 quốc gia đối v i 30 thu c tr sâu trên n n m u và tr ành ớ ố ừ ề ẫ ở th phương pháp chính thức c a AOủ AC 2007.01 [21] vào năm 2007. Cùng thời gian đó, Anastassiades và cộng s ự ở Stuttgart, cũng phát triển một phương pháp QuEChERS khác
s dử ụng đệm citrat ở pH 5. Phương pháp này đã được thẩm định liên phòng nhi u ở ề phòng thí nghiệm ở Đức và năm 2008 tr thành phương pháp châu Âu EN 15662 [38].ở 1.4.1. Phương pháp QuEChERS EN15662
Đầu tiên Michelangelo Anastassiades [32] đề xu t quy trình QuEChERS như sau: ấ - Giai đoạn x lý m u : M u nông sử ẫ ẫ ản ban đầu (cách l y m u tùy thu c vấ ẫ ộ ào đối tượng và theo hướng d n phòng thí nghi m hoẫ ệ ặc theo quy định qu n lý cả ấp cao hơn ) được x ử lý sơ bộ như : lo i b phạ ỏ ần đất, sỏi ... không liên quan. Sau đó mẫu được nghi n ề nh , mỏ ịn (lý tưởng là được nghi n trề ạng thái đông lạnh) để ả gi m tối đa sự khác bi t trong ệ m t mộ ẫu và tăng tối đa b m t ti p xúc cho quá trình chi t. V i nh ng mề ặ ế ế ớ ữ ẫu thô như hoa qu ả thì được cắt ở kích cỡ < 3x3 cm sau đó mới đem đồng nh t mấ ẫu. Sau khi đồng nhất mẫu được cân một lượng phù hợp để phân tích ngay ho c b o qu n nhiặ ả ả ệ ột đ < -20oC.
- Cân 10 15 gam/m u vào ng tuyp ly tâm lo i 50ml có n p kín. V i m u có hàm – ẫ ố ạ ắ ớ ẫ lượng nước thấp như chè, gạo, ngũ cốc thì cần thêm nước vào để hàm lượng nước > 75% để trong 2 h.
28
- Thêm 10 ml axetonitril (ACN) rung l c m nh kho ng 2 ắ ạ ả – 3 phút. Sau đó thêm MgSO4, NaCI, h n h p muỗ ợ ối đệm xitrat Na3C6H5O7và Na2C6H6O7 sao cho pH mẫu đạt 5 -5,5 [32].
- Rung l c m nh 2-ắ ạ 3 phút và ly tâm 3000vòng/phút trong 5 phút để pha hữu cơ được phân tách. Thu pha hữu cơ và thêm các chấ ất h p ph ụ amin như PSA, than hoạt tính (GCB) để làm s ch lo i b ạ ạ ỏ cơ c ấh t th c v t, ch t di p l c. Ti n hành ly tâm l n n a, thu ự ậ ấ ệ ụ ế ầ ữ l y pha hấ ữu cơ đem thổi khô b ng khí Nằ 2. Tùy thu c thi t b phân tích là h ộ ế ị ệ GC- MS/FPD/µECD hay HPLC-MS/MS mà định mức bằng dung môi thích h p [36]. ợ
Hiện nay để thu n ti n trong chiậ ệ ết tách người ta đóng gói sẵn h n h p muỗ ợ ối vô cơ, muối đệm, ch t làm s ch (PSA, GCB) thành nh ng b kit (d ng dung d ch ho c d ng bấ ạ ữ ộ ạ ị ặ ạ ột
r t m n). Hiấ ị ển nhiên tùy theo đối tượng nông s n và ho t ch t pesticide quan tâm mà ả ạ ấ thành ph n m i b kit là khác nhau. Chính vì có nhi u ho t ch t và nhi u lo i nông sầ ỗ ộ ề ạ ấ ề ạ ản khác nhau mà hi n nay t n tệ ồ ại nhiều quy trình khác nhau.
29
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên c u là 7 hóa ch t b o v th c v t g m: Acetamiprid, Acephate, ứ ấ ả ệ ự ậ ồ Buprofezin, Chlorothalonil, Fipronil , Hexaconazole và Profenofos trong m u chè khô. ẫ 2.1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
M c tiêu chung cụ ủa đề tài là nghiên cứu phương pháp xác định đồng th i 7 ờ HCBVTV nông s n bả ằng phương pháp sắc ký l ng kh i ph - ỏ ố ổ khối ph LC/MS/MS v i 2 ổ ớ mục tiêu cụ thể như sau:
- Khảo sát các điều ki n phân tích ệ - Thẩm định phương pháp đã xây dựng 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Chuẩn bị dung môi pha động và dung dịch chuẩn- Chuẩn b ị dung môi pha động - Chuẩn b ị dung môi pha động
Dung d ch kênh Aị : ACN/H2O 2+8 (v/v) + 5mM CH 3COONH4: Cân 0,385g CH3COONH4vào bình định mức 1L, thêm 200ml ACN, định m c t i v ch bứ ớ ạ ằng nước cất 2 l n kh ion, l c k , siêu âm 15 min.L c dung d ch qua màng l c 0,45 ầ ử ắ ỹ ọ ị ọ m trước khi đưa vào h ệ thống HPLC-MS/MS.
Dung d ch kênh Bị : ACN/H2O 9+1 (v/v) + 5mM CH 3COONH4: Cân 0,385g CH3COONH4vào bình định mức 1L, thêm 900ml ACN, định m c t i v ch bứ ớ ạ ằng nước cất 2 l n kh ion, l c k , siêu âm 15 min . L c dung d ch qua màng l c 0,45 ầ ử ắ ỹ . ọ ị ọ m trước khi đưa vào hệ ố th ng HPLC-MS/MS.
- Chuẩn b dung dich chu n ị ẩ
+ Dung dịch chu n gốc – 1000 g/mlẩ µ
Cân kho ng 0,01g các ch t chu n chính xác tả ấ ẩ ới 0,00001g vào bình định m c 10 ml, ứ hoà tan và định m c t i v ch bứ ớ ạ ằng axetonitril được dung d ch chu n g c. ị ẩ ố
Chú ý: Do ch t chu n b o qu n - 20ấ ẩ ả ả ở oC nên phải đưa về nhiệt độ phòng trước khi cân. Dung dịch chu n sau khi pha b o qu n 0 -5 ẩ ả ả ở oC
30
B ng cách pha loãng liên tằ ục và định m c b ng h n hứ ằ ồ ợp dung môi pha động và ACN được các m c nứ ồng độ chu n làm vi c 4, 10, 20, 40, 100 ng/ml. ẩ ệ
2.2.2. Các hoá chất khác
Các lo i hóa chạ ất dùng trong phương pháp phân tích đều thu c lo i hóa ch t tinh ộ ạ ấ khi t phân tích (P.A.) g m : ế ồ