CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích dư lượng 7 HCBVTV
3.1.1. Tối ưu hoá các điều kiện đo trên thiết bị HPLC – MS/MS
3.1.1.1. Khảo sát các điều kiện hệ thống HPLC3.1.1.1.1. Chọn điều kiện bơm mẫu 3.1.1.1.1. Chọn điều kiện bơm mẫu
V i h ớ ệ thống HPLC MS/MS 6410MS (Agilent), b ph– ộ ận bơm mẫu là t ự động (Auto Sampler). Mẫu đã chuẩn bị ạ n p vào ống 2ml đặt trong khay, sau đó cánh tay roboot s hút chính xác và n p m u vào vòng m u b ng 1 xi lanh áp su t cao, sau nh h ẽ ạ ẫ ẫ ằ ở ấ ờ ệ thống chuy n van mà mể ẫu được dòng pha động n p vào cạ ột tách.
Để phù h p c u hình máợ ấ y và đạt được yêu c u v ầ ề độ chính xác, độ ặ ạ ủ l p l i c a thi t ế b , chúng tôi ch n th ị ọ ể tích bơm mẫu là 20 µl vì khi đó sai số ằ n m trong gi i h n ki m soát ớ ạ ể (theo nhà s n xu t ), không ả ấ ảnh hưởng đến thành phần dung môi pha động. Lượng cơ chất thực v t và HCBVTV trong m u v n n m trong gi i hậ ẫ ẫ ằ ớ ạn cho phép đố ới v i kh ả năng phân giải của cột tách (theo phương pháp tách chiết ).
Toàn bộ các mẫu trên khay được ổn nhi t tại 10ệ 0C và thời gian bảo quản mẫu < 24h. 3.1.1.1.2. Chọn cột tách
C t tách góp m t ph n khá quan tr ng trong vi c quyộ ộ ầ ọ ệ ết định quá trình tách có độ phân gi i tả ốt hay không. Để chọn lo i cạ ột có pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào c u trúc ấ phân t ử và độ phân c c c a ch t phân tích. Vự ủ ấ ới đối tượng c n tách là ầ 7 HCBVTV đều có
tính ch t tan tấ ốt trong nước, pha động phân c c nên c t tách s d ng ph i là c t pha ự ộ ử ụ ả ộ ngược. Trong nghiên c u này chúng tôi s d ng c t Agilent ZorbaxSB C18 v i các thông ứ ử ụ ộ ớ s cố ột như sau:
ZorbaxSB C18 (150mm × 4.6mm × 5µm) hoặc tương đương Nhiệ ột đ cột: 400C
3.1.1.1.3. Khảo sát thành phần pha động và chế độ chạy
Pha động và pha tĩnh là hai yếu t tr c ti p ố ự ế ảnh hưởng tới điều ki n tách s c ký. ệ ắ Việ ực l a chọn pha động r t quan trấ ọng vì pha động có th ể ảnh hưởng tới độ ch n l c c a ọ ọ ủ
38
HCBVTV trong nghiên c u tan tứ ốt trong nước và căn cứ giá thành đề tài đã chọn h dung ệ môi là nước và acetonitril 5 [2 ].
3.1.1.1.4. Khảo sát tốc độ dòng pha động
Tốc độ dòng pha động liên quan đến quá trình thi t l p cân b ng c a ch t tan trong ế ậ ằ ủ ấ hai pha tĩnh và pha động. Khi tốc độ pha động nh , ch t phân tích ra mu n, gây doãng ỏ ấ ộ chân pic, giảm độ nh y và tạ ốn dung môi. Ngượ ạc l i, khi tốc độ pha động quá l n có th ớ ể làm cho các ch t trong h n h p mấ ỗ ợ ẫu chưa kịp tách ra kh i nhau, dỏ ẫn đến hiện tượng chồng pic và gây áp su t lớn trong bơm [14 ấ ].
Trong ch ế độ chạy tr n dung môi, khi c nh ch ộ ố đị ế độ đo phần MS/MS b ng cách ằ tăng dầ ỷ ện t l ACN và thay đổ ốc độ pha đội t ng các m c:0,5; 0,6; 0,7 ; 0,8 ; 0,9 và 1 ở ứ ml/phút căn cứ độ ẹp pic, độ h cân x ng cứ ủa pic để ự l a ch n. Th c nghi m cho th y t i t ọ ự ệ ấ ạ ỷ l ệ thể tích c a hai kênh A và kênh B là 65% : 35%, tủ ốc độ dòng là 0,6 ml/phút píc thu được nh n, họ ẹp và cân đối.
Hình 3.1: Sắc ký tổng ủa ácc c HCBVTV
Chúng tôi nh n th y tậ ấ ốc độ dòng th c nghi m (0,6 ự ệ ml/phút) nh ỏ hơn so mức khuyến cáo c a nhà s n su t ủ ả ấ (1 ml/phút). Nhưng điều này là phù hợp vớ ệ thối h ng HPLC-MS/MS vì tốc độ dòng thấp sẽ thu n lậ ợi cho quá trình hóa hơi dung môi, tách và ion hóa hoạt chất phân tích của nguồn ion hóa ESI.
39
Bảng 3. Điều kiện tốc độ dòng pha động để tách hỗn hợp HCBVTV1. Thời gian
(phút)
Tốc độ dòng
(mL/phút) Kênh A Kênh B
0-7 0,6 65 35
3.1.1.2. Khảo sát các điều kiện khối phổ MS/MS
Để phân tích HCBVTV bằng sắc ký lỏng khối phổ MS/MS cần phải xác định được ion phân tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) của HCBVTV. Với nguồn ion hóa ESI, chế độ ion dương các ion phân tử thường được tạo thành bằng cách thêm một proton vào khối lượng phân tử của chất đó. Dựa vào khối lượng phân tử của các HCBVTV, trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu trước đây trên thế giới, chúng tôi đã xác định được các ion phân tử của từng HCBVTV (bảng 2.2 ).
Tuy nhiên, để định tính và định lượng cần phải xác định được ion sản phẩm của từng HCBVTV. Sử dụng kim tiêm mẫu 20 µl tiêm trực tiếp các chất chuẩn HCBVTV có nồng độ 100 ng/ml vào MS để xác định hai ion con ứng với từng chất. Ion con có tín hiệu lớn hơn được sử dụng để làm ion định lượng, ion con có tín hiệu thấp hơn được dùng cho mục đích xác nhận (khẳng định). Các thông số bắn phá như Dwell time (Chu kỳ quét), Fragmentor (Điện áp phân mảnh), và CE (năng lượng va chạm) được tối ưu tự động theo thiết bị MS. Các kết quả được tổng hợp ở bảng 2.2.
Bảng 3. Điều kiện tối ưu cho thiết bị HPLC –2: MS/MS
HPLC MS/MS
T l kênh A : B = 65% 35% ỷ ệ : Chế độ ion hóa : ESI-posetive và negative
Tốc độ dòng : 0,6 ml/phút Chu kỳ quét : theo bảng 2.2 Áp suấ ầt đ u phun :4000V Điện thế phân mảnh : theo bảng 2.2
40
3.1.2. Nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp3.1.2.1 Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp 3.1.2.1 Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp
Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp phân tích đa dư lượng thể hiện khả năng phân biệt một chất với các chất còn lại và với nền mẫu. Để đánh giá tính chọn lọc, đặc hiệu chúng tôi phân tích các mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Hình 3.4 và 3.5 giới thiệu sắc đồ của hỗn hợp chuẩn trên mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn.
Mẫu trắng là mẫu không chứa các HCBVTV trong nghiên cứu, được thực hiện theo quy trình chiết mẫu (Hình 2.1).
Mẫu thêm chuẩn là mẫu trắng được bổ sung thêm một lượng chất chuẩn cần phân tích đã biết trước nồng độ. Mẫu thêm chuẩn được chuẩn bị và phân tích như đối với các mẫu thực để xem xét quá trình thực hiện của một phương pháp phân tích.
Hình 3. . Sắc đồ pic mẫu trắng2 và m êm chu ẫu th ẩn
Nhận xét: Thời gian lưu của các HCBVTV trên nền mẫu thêm chuẩn hoàn toàn giống với trên mẫu chuẩn (hình 3.1), không xuất hiện pic ở mẫu trắng ở cả hai ion con..
Mặt khác, với mỗi chất ta có hai ion con dùng để định lượng và khẳng định do đó sự có mặt của HCBVTV được chắc chắn. Điều này đáp ứng được yêu cầu của các tổ chức trên thế giới như AOAC, Châu Âu [21,22, 37, 38].
3.1.2.2. Khảo sát xây dựng đường chuẩn
Tiến hành kh o sát s ph thu c c a di n tích pic s c ký vào nả ự ụ ộ ủ ệ ắ ồng độ ủ c a các chất chuẩ đển tìm gi i h n tuy n tính và lớ ạ ế ập đường chu n. T dung d ch chu n g c (stock) pha ẩ ừ ị ẩ ố các dãy dung dịch chu n sau : ẩ
41
- Dãy dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ là : 4 10 20; 40; 100 ng/ml ; ;
ch chu n trung gian pha trong ACN. Dung d ch chu n làm Trong đó các dung dị ẩ ị ẩ việc định mức bằng h n h p ACN. ỗ ợ
ng HPLC- u ki trên. Tiến hành bơm vào hệ thố MS/MS theo các điề ện đã tối ưu ở T i m i nạ ỗ ồng độ ặ ạ l p l i 2 l n ,riêng t i nầ ạ ồng độ 4 ng/ml thì l p l 5 l n ặ ại ầ để đánh gi th m á ê độ ặ ạ ủ l p l i c a thi t b . ế ị
K t qu kh o sát các thông s bi u di n s ế ả ả ố ể ễ ự phụ thuộc gi a nữ ồng độ ủa Ac c ephate và diện tích pic tương ứng được thể ệ hi n trong b ng 3.3ả :
Bảng 3. : Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chuẩn 3 Acephate Tên Kiểu mẫu
Các mức nồng độ (ng/ml) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (pA*Hz) ACN DM ACN DM ACN DM Acephate 4 ng/ml Chuẩn L5 2.887 12518.8 Acephate 4 ng/ml Chuẩn L5 2.888 12657.6 Acephate 4 ng/ml Chuẩn L5 2.887 12643.1 Acephate 4 ng/ml Chuẩn L5 2.886 12502.7 Acephate 4 ng/ml Chuẩn L5 2.890 12452.4 Acephate 10 ng/ml Chuẩn L4 2.895 27104.3 Acephate 10 ng/ml Chuẩn L4 2.895 27137.2 Acephate 20 ng/ml Chuẩn L3 2.895 56444.3 Acephate 20 ng/ml Chuẩn L3 2.895 56458.4 Acephate 40 ng/ml Chuẩn L2 2.895 116196.0 Acephate 40 ng/ml Chuẩn L2 2.895 116189.2 Acephate 100 ng/ml Chuẩn L1 2.887 304898.0 Acephate 100 ng/ml Chuẩn L1 2.886 304884.6
42
T k t qu ừ ế ả thu được ở b ng 3.3ả , úng tôi s d ng ph n m m Agilent-Mass Hunter ch ử ụ ầ ề B1.0 giúp lập đường chu n b c nh t d ng h i quy kh c a ẩ ậ ấ ạ ồ ối ủ Acephate t để ừ đó xác định được giá tr LOD và LOQ . ị
Hình 3.3: Đường chuẩn của Acephate trong khoảng tuyến tính
Xây d ng ự đường chuẩ cho 6 hoạ chấn t t còn l i, chúng tôi thu ạ đượ ố liệ đườc s u ng chuẩ ởn b ng 3.4ả như sau:
Bảng 3.4: Các thông số đường chuẩn đối với các HCBVTV Tên chất Hệ số tương
quan r 2 Độ lệch chuẩn S y Phương trình đường chuẩn Acetamiprid 0.99797736 26.9 y= 282.975980x+38.549299
Acephate 0.99828271 26.26 y = 2996.328768x-840.188037 Buprofezin 0.99992172 213.5 y = 1142.127012x-390.090539 Chlorothalonil 0.99998223 1.7 y = 8.886794x-58.918961 Fipronil 0.99937748 7.8 y = 187.753875x-0.907532 Hexaconazo le 0.99842735 290.2 y = 346.070417x-476.662911 Profenofos 0.99903714 28.8 y 43.944084-3.930505 =
43
K t qu phân tích cho thế ả ấy phương trình hồi quy c a ủ Acephate là b c nh t có d ng : ậ ấ ạ y = 2996.328768x-840.188037 trong đó y là diện tích pic, x là nồng độ chất chu n ẩ bơm vào (ng/ml); h s ệ ố tương quan r2 = 0.99828271; độ ệ l ch chu n cẩ ủa phương trình hồi quy là Sy 26.26 = (bảng 3.4)
Thực nghiệm cũng cho thấy khi bơm lặp l i ạ 5 l n t i nầ ạ ồng độ thấp nh t 4 ng/ml, ấ theo các điều ki n tệ ối ưu tìm được thì thi t b có đ ế ị ộ ổn định cao (RSD% < 7%)(b ng 3.5) ả
Bảng 3. : Độ lặp lại của thiết bị tại nồng độ 5 4 ng/ml
Tên ch t ấ Lần bơm mẫu RSD (%)
1 2 3 4 5
Acetamiprid 157.8 146.5 152.3 157.1 165.5 4.520 Acephate 12518.8 12657.6 12643.1 12502.7 12452.4 0.722 Buprofezin 4298.6 4380.5 4354.7 4460.3 4484.5 1.740 Chlorothalonil 12.5 13.6 12.5 14.5 12.7 6.659 Fipronil 79.2 71.3 67.5 74.2 68.8 6.476 Hexaconazo le 1057.6 1021.3 1088.9 1045.8 1022.5 2.671 Profenofos 172.4 159.2 188.7 162.3 165.6 6.914
V i k t qu khớ ế ả ảo sát độ ặ ạ ủ l p l i c a thi t b ta th y thi t b ế ị ấ ế ị đáp ứng t t cho nghiên ố c u, kứ ết quả có độ ặ ại giữa các lầ l p l n phân tích mà giá tr ị RSD đáp ứng được yêu cầu. 3.1.2.3. Giới hạn phát hiện LOD
Giớ ại h n phát hiện (LOD) được định nghĩa là nồng độ ấ th p nh t (xấ L) c a ch t phân ủ ấ tích mà h ệ thống phân tích còn cho tín hi u phân tích (yệ L) khác có nghĩa v i tín hi u c a ớ ệ ủ m u tr ng hay tín hi u n n. T c là: yẫ ắ ệ ề ứ L= yB +kS.B với y là tín hi u trung bình c a mB ệ ủ ẫu trắng sau nb thí nghi m; Sệ blà độ ệ l ch chu n tín hi u c a m u trẩ ệ ủ ẫ ắng; k là đại lượng s hố ọc được chọn theo độ tin c y mong mu n 1 ậ ố [1 ].
44 = = b n j bj b b y n y 1 1 = − − = b n i b bi b b x x n S 1 2 2 ( ) 1 1 , như vậy, b S k x x B B L . + =
Chúng tôi xác định gi i h n phát hi n LOD b ng tính toán, theo lí thuy t th ng kê trong ớ ạ ệ ằ ế ố hoá phân tích [9]
b S LOD=3. y (*) Trong đó:
- b là h s ệ ố trong phương trình hồi quy y = 2996.328768x-840.188037
- Sylà độ ệ l ch chu n c a m u trẩ ủ ẫ ắng, được coi b ng sai s cằ ố ủa phương trình ồ h i quy Sb = Sy 262.6 . = Như vậy xLOD = 0,94 ng/ml.
3.1.2.4. Giới hạn định lượng LOQ
Giới hạn định lượng được định nghĩa là nồng độ nh nh t c a ch t phân tích mà ỏ ấ ủ ấ phép phân tích vẫn định lượng được chính xác với độ tin c y 95%. Theo lý thuy t th ng ậ ế ố kê trong hoá phân tích thì LOQ là nồng độ chất phân tích mà cho tín hi u g p 10 l n tín ệ ấ ầ hiệu đường n n (S/N = 10). ề
b S XLOQ = 10. y
Vì vậy, gi i hớ ạn định lượng c a ế ị ớủ thi t b v i ho t ch t ephate là ạ ấ ac XLOQ = 3.12 ng/ml Kết quả giá tr LOD, LOQ cị ủa thiết bị được ch ỉ ra trong bảng 3. 6
45 Tên chất Hệ số b Độ lệch
chuẩn S y
LOD LOQ
Acetamiprid 38.549299 2.69 0.21 0.70 Acephate 840.188037 262.6 0.94 3.12 Buprofezin 390.090539 21.35 0.16 0.55 Chlorothalonil 58.918961 1.7 0.09 0.29 Fipronil 0.907532 0.08 0.26 0.88 Hexaconazo le 476.662911 29.02 0.18 0.61 Profenofos 3.930505 0.29 0.22 0.74
Kết luận về hoả k ng tuyến tính:
Do thi t b HPLC ế ị – MS/MS có độ nhậy và độ chọ ọ ấ ốn l c r t t t có th phân bi t tể ệ ới fentogram/ml nên khi tăng nồng độ ch t phân tích có th làm nhi m b n h th ng. Vì v y ấ ể ễ ẩ ệ ố ậ chúng tôi ch n nọ ồng độ phân tích t 4 ừ ng/ml đến 100 ng/ml (nh m gi m s l n ch y chằ ả ố ầ ạ ất chuẩn trong m t dãy m u phân tích) và s ộ ẫ ẽ đánh giá hiệu su t thu h i , %RSD trên kho ng ấ ồ ả này.
3.1.2.5. Khảo sát điều kiện chiết hỗn hợp chuẩn trong mẫu thực
Trong phân tích lượng vết, cơ chất thực vật có ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả phân tích. Làm sạch là giai đoạn quan trọng phải đảm bảo mẫu chạy ổn định, nhiễu nền ít ảnh hưởng đến kết quả và tránh làm bẩn làm hỏng với detecter cho hệ MS/MS vốn rất nhạy. Các chất làm sạch được lựa chọn phải đáp ứng hấp phụ cơ chất thực vật nhưng không hấp phụ hoạt chất cần phân tích. ác chất làm sạch được lựa chọn là :C
- Than hoạt tính GCB : dùng khử các chất diệp lục, chất tạo mầu - Bột C18EC : dùng khử các chất béo, lipid, protein...
46
- QuEchERS EN 15662 sử dụng chất làm sạch PSA (Primary-secondary amine - chất hấp phụ amin bậc 1,2)
Thực nghiệm cho thấy GCB hiệu quả làm sạch cơ chất cao nhưng hầu như hấp thụ hầu hết HCBVTV trong nghiên cứu cơ chất giảm đi rõ rệt. Vì vậy chúng tôi không chọn , GCB trong nghiên cứu này, thay vào đó, chúng tôi chọn PSA, vì PSA không hấp thụ các HCBVTV trong nghiên cứu này. Bằng cảm quan và xem xét tín hiệu đường nền của phổ chúng tôi chọn lượng MgSO4 và PSA lần lượt 4g; 0,3g để làm sạch mẫu sau đó nghiên cứu các điều kiện chiết HCBVTV ra khỏi mẫu .
3.1.2.6. Khảo sát ảnh hưởng thể tích 5% acid formic đến hiệu suất thu hồi
Cân 10 g/m u ẫ trắng (cân 7 lượng cân), thêm 0,1 ml dung d ch chu n Mix 7 1000 ị ẩ ng/ml vào m i mỗ ẫu, sau đó thêm 10 ml ACN. Thêm các th tích acid formic khác nhau ể như ở ả b ng 3.7 vào 2 ml d ch chi t cuị ế ối cùng trước khi bơm vào máy. ửX lý m u v i quy ẫ ớ trình chi t ế ở trên rồi bơm vào hệ ốth ng HPLC MS/MS ch– ạy các điều ki n tệ ối ưu đã khảo sát ởtrên. Nồng độ ẫ m u thêm chuẩn thu được tính theo đường chu n. ẩ
Bảng 3.7 Ảnh hưởn: g Vacid rmicfo đến hiệu suất thu hồi trên mẫu thêm chuẩn m (g) Vacid formic (μl) S ml chu n 1000 ố ẩ (ng/ml) thêm vào Nồng độ chu n ẩ thêm vào (ng/ml) Hiệu suất thu h i ồ