Cân 10 g/m u ẫ trắng (cân 7 lượng cân), thêm 0,1 ml dung d ch chu n Mix 7 1000 ị ẩ ng/ml vào m i mỗ ẫu, sau đó thêm 10 ml ACN. Thêm các th tích acid formic khác nhau ể như ở ả b ng 3.7 vào 2 ml d ch chi t cuị ế ối cùng trước khi bơm vào máy. ửX lý m u v i quy ẫ ớ trình chi t ế ở trên rồi bơm vào hệ ốth ng HPLC MS/MS ch– ạy các điều ki n tệ ối ưu đã khảo sát ởtrên. Nồng độ ẫ m u thêm chuẩn thu được tính theo đường chu n. ẩ
Bảng 3.7 Ảnh hưởn: g Vacid rmicfo đến hiệu suất thu hồi trên mẫu thêm chuẩn m (g) Vacid formic (μl) S ml chu n 1000 ố ẩ (ng/ml) thêm vào Nồng độ chu n ẩ thêm vào (ng/ml) Hiệu suất thu h i ồ (%) 10 0 0,1 10 66,4 10 2 0,1 10 73,2 10 5 0,1 10 86,4 10 10 0,1 10 83,6 10 25 0,1 10 33,6 10 20 0,1 10 13,0 10 25 0,1 10 10,2
T ừ các ố liệ s u b ng 3.8, ta th y khi thêm 10 µl axit formic vào 10 ml d ch m u thì hi u ả ấ ị ẫ ệ suất chiết đạt giá tr cị ực đại và pic s c ký c a m u tr ng êm ắ ủ ẫ ắ th chuẩn và chuẩn tương tự nhau (hình 3.7, 3.8).
47
Hình 3.4: Sắc ký đồ EIC và phổ khối Fipronil c ủa mẫu thêm chuẩn tại 10 ng/ml
Hình 3.5: Sắc ký đồ EIC và phổ khối của chuẩn Fipronil tại 10 ng/ml 3.1.2.7. Đánh giá độ chính xác của phương pháp
Độ chính xác của phương pháp phân tích có ý nghĩa quyết định giá xem phương pháp phân tích có kh ả năng ứng d ng hay khôngụ . Theo ISO 5725: 1994 độ chính xác của
48
phương pháp (accuracy) được đánh giá qua độ đúng (truness) và độ ch m (precision) ụ [1 ].2
Trong đó độ đúng được đánh giá qua độ ch ch ệ – Bias (tương đương với hi u su t ệ ấ thu hồi – Recovery) bao gồm độ chệch trong n i b phòng thí nghiộ ộ ệm (Laboratory bias) và th nghi m liên phòng .Vử ệ ớ ội đ chụm chúng tôi đánh giá qua độ ệ l ch chu n l p l ẩ ặ ại.
Độ chụm là đại lượng dùng để ch mỉ ức độ ầ g n nhau c a các giá tr riêng l xủ ị ẻ i c a ủ các phép đo lặ ại. Nói cách khác độp l chụm được dùng để ch s sai khác gi a các giá tr ỉ ự ữ ị xi so v i giá tr trung bìnhớ ị x, đại lượng đặc trưng cho độ chụm là độ ệ l ch chuẩn tương đối %RSD (hay còn được ọg i là h s bi n thiên CVệ ố ế ) được tính theo các công th c ứ dưới đây: [9 ]. 100 (%) = tb S SD RSD l n c a di n tích ho c n ch y Trong đó: SD là độ ệch chuẩ ủ ệ ặc kết quả ủa n lầ ạ Stblà diện tích trung bình hoặc kết quả trung bình của n lần ch y ạ
Độ chụm được tính toán d a trên vi c làm thí nghi m l p l i nhi u m u v i các ự ệ ệ ặ ạ ề ẫ ớ điều ki n hóa ch t, thu c th và thi t b ệ ấ ố ử ế ị như nhau để đánh giá độ ch m cụ ủa phương pháp phân tích.
Chúng tôi ti n phân tích s dế ử ụng phương pháp thêm chuẩn. T i m i m c thêm ạ ỗ ứ chuẩn, làm l p 5 m u, tính hi u su t thu hồi và độ ệặ ẫ ệ ấ l ch chuẩ ặ ại, độn l p l ụch m của phương pháp phân tích.
Bảng 3.8: Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn
m (g) Mô tả S ml chuốthêm vào ẩn Chuẩn lý thuy t (ng/ml) Nồng đếộ 10 M u thêm chu n n=5 ẫ ẩ ; 0,04 ml
C = 1000 ng/ml 4 10 M u thêm chu n n=5 ẫ ẩ ; C = 1000 ng/ml 0,1 ml 10 10 M u thêm chu n n=5 ẫ ẩ ; 0,2 ml
49
Trên n n m u tr ng th c hi n l p l i 5 l n t i m i giá tr nề ẫ ắ ự ệ ặ ạ ầ ạ ỗ ị ồng độ , tính độ thu hồi theo đường chu n ẩ
Bảng 3.9: Độ thu hồi của từng HCBVTV
Tên ch t ấ RSD trung bình (%) 4 (ng/ml) 10 (ng/ml) 20 (ng/ml) Độ thu h i ồ (%) RSD (%) Độ thu h i ồ (%) RSD (%) Độ thu h i ồ (%) RSD (%) Acetamiprid 6.53 81.2 6.55 90.4 6.5 102.6 6.54
Acephate 5.51 84.9 5.48 97.4 5.56 112.3 5.49 Buprofezin 5.54 86.6 5.34 94.7 5.44 108.5 5.84 Chlorothalonil 6.48 63.1 6.24 82.2 6.61 94.5 6.59 Fipronil 6.35 65.3 6.46 81.9 6.33 96.7 6.26 Hexaconazo le 4.46 87.4 4.63 95.1 4.38 114.8 4.37 Profenofos 5.32 80.5 5.13 93.6 5.75 111.9 5.08
V giá t l thu h cho ph là 80-120%, cới trị ỷ ệ ồi ép ác kết quả cho thấy 5 ch ất Acetamiprid, Acephate, Buprofezin, Hexaconazole và Profenofos đạt yêu c v m ầu ới ức nồng độ thấp nh 4 ng/ml; 2 ch ất ất Fipronil và Hexaconazole đạt yêu c m nầu ở ức ồng độ 10 ng/ml. Qua vi ệc đánh giá độ đúng ủa c ph ng ph , chúng tôi x nh gi i h ươ áp ác ận ớ ạn định
lượng LOQ c ph ng ph là 4 ng/ml v 5 ho ủa ươ áp ới ạt chất Acetamiprid, Acephate, Buprofezin, Hexaconazole và Profenofos và 10 ng/ml v 2 ho t ch còn l . i n ới ạ ất ại Đ ều ày cho th ấy các chất có thể định lượng được tại nồng độ thấp hơn hoặc bằng giá trị MRL chung (10 ng/ ) mà ml không cần thêm bước làm giàu, làm sạch như các phương pháp phân tích cũ Hiệu suất thu hồi cao ừ. t 80 115%. – Phương pháp đáp ứng được yêu cầu để ứng dụng phân tích HCBVTV.
50 3.2. K ết quả ph n tích ột ố ẫu ch thực ế â m s m è t
Phương pháp phân tích sau khi đã chuẩn hóa đượ ức ng dụng để phân tích lượng t n ồ dư HCBVTV trong các mẫu è khác nhau. ch
Dư lượng là lượng ho t ch t thu c BVTV, d n xu t và các s n ph m chuy n hóa ạ ấ ố ẫ ấ ả ẩ ể c a thuủ ốc BVTV có độc tính còn lưu lại trong nông sản hàng hóa và môi trường sau khi s d ng ử ụ thuốc BVTV.
Chúng tôi th nghiử ệm ới v 3 m è xu kh c 3 doanh nghi xu kh è ẫu ch ất ẩu ủa ệp ất ẩu ch l khu v ph B g ớn ở ực ía ắc ửi đến Trung Tâm Kiểm Định và Khảo Nghiệm Thu BVTV ốc Phía B kiắc để ểm định áng 7/2108 nh th ư sau:
M 1: Công ty TNHH th phẫu ực ẩm Phú T nông trài – ường Trần Ph – ă ú V n Ch ấn – Yên B . ái
M 2: Công ty TNHH Thu ẫu ận Phát – Th ôn D N Xã ục ội – Việt Hùng – Đông Anh – Hà N . ội
M 3: Doanh nghi ẫu ệp chế ến bi và xu kh è YI JIIN ất ẩu ch – Thôn Yên Thông Xã – Bình Yên - Huyện Định Ho – Thái Nguyá ên.
T c 3 m è ất ả ẫu ch đều kh ông ph hi d lát ện ư ượng thuốc BVTV, s hắc đồ ình 3.6
51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Đề tài Nghiên c“ ứu phương pháp phân tích đa dư lượng ho t ch t thu c BVTV trong ạ ấ ố chè” đã thu được các kết quả sau :
- Đã khảo sát và chọn được các thông số ối ưu cho q t uá trình ch y sạ ắc ký: cột tách ột C Zorbax SB18 150mm x 4,6mm, 5µm, t l kênh A : kênh B = 65 35 (5 mM ỷ ệ :
CH3COONH4) và tốc độ dòng là 0,6 ml/phút.
- Đã ứng d ng và c i tiụ ả ến thành công phương pháp QuEChERS cho phân tích đa dư lượng theo hướng s d ng ít dung môi hử ụ ữu cơ độc hại, tăng hiệu qu phân tích, gi m giá ả ả thành. Thay đổi quy trình x lý m u b ng 5% acid ử ẫ ằ formic phù hợp v i m u phân tích, cho ớ ẫ hi u su t thu h trên 80%. ệ ấ ồi
- Tiến hành đánh giá và xác nhận giá tr s d ng c a ị ử ụ ủ phương pháp phân tích cho th : ấy LOQ = 4 ng/ml (Acetamiprid, Acephate, Buprofe n, Hzi exaconazole và Profenofos) và 10 ng/ml (Fipronil và Chlorothalonil), %Recovery = 80-115%, RSD% < 7 cho thấy phương pháp xây dựng được có độ ặ l p t t, hi u su t thu hố ệ ấ ồi cao hoàn toàn đáp ứng được cho nh ng nông s n. ữ ả
Kiến ngh ị:
- Tiếp tục mở rộng đối tượng nghiên cứu tăng số lượng HCBVTV trong một lần phân tích.
- Phương pháp xác định dư lượng HCBVTV trên LC-MS/MS đã nghiên cứu cần nghiên c u thêm v ứ ề đánh giá độ không đảm bảo đo và tham gia th nghi m thành th o. ử ệ ạ
52
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Vi t ệ
1. B Nông nghi p và PTNT. (1999), ộ ệ “Phương pháp lấy m u kiẫ ểm định chất lượng và dư lượng thuốc BVTV” 10TCN 386-99 .
2. B Nông nghi p và PTNT. (2018), ộ ệ “Danh m c các lo i thuụ ạ ốc được phép s d ng ử ụ ở Việt Nam”, 2018 .
3. B Nông nghi p và phát tri n nông thôn (2018ộ ệ ể ), Thông tư số:21/2018/TTBNNPTNT ngày 8 tháng 6 năm 2018 Ban hành danh m c thu c b o v th c vụ ố ả ệ ự ật được phép s d ng, ử ụ h n ch s d ng, cạ ế ử ụ ấm sử ụ d ng và danh mục bổ sung giống cây trồng được phép sản xuất, kinh doanh ở Vi t Nam. ệ
4. Đào Văn Hoằng. (2005), K ỹ thuật tổng h p các hóa chợ ất bảo v ệ thực vật, Nhà xu t bấ ản khoa học và k ỹ thuật, Hà N i. ộ
5. Lê Bá Th o (Ch nh sả ỉ ửa Hoàng Lan Tôn). 2001. “Việt Nam Lãnh th – ổ và các vùng địa lý, NXB Thế Giới, Hà Nộ i.
6. TS. Lê Trường, PGS.TS. Nguy n ễ Trần Oánh, TS. Đào Trọng Ánh (2005), T ừ điển s ử d ng thu c b o v ụ ố ả ệ thực vật ở Việt Nam, NXB Nông nghi p, Hà N i ệ ộ
7. Nguyễn M nh Chinh (2012), ạ C m nang thu c b o v ẩ ố ả ệ thực v tậ , NXB Nông nghi p, Hà ệ N ội.
8. Phạm Hùng Vi t (2003), ệ Cơ sở lý thuy t cế ủa phương pháp sắc ký khí, Nhà xu t bấ ản khoa h c và k ọ ỹ thuật, Hà N i. ộ
9. Ph m Lu n (1999), ạ ậ Cơ sở lý thuy t s c ký l ng hiế ắ ỏ ệu năng cao, Trường đại học Quốc gia Hà N i ộ.
10. PGS.TS. Nguyen Tr n Oánh, TS. Nguyen V n Viên , KS.Bùi Tr ng Th y. (2007), ầ ă ọ ủ “Giáo trình sử ụ d ng thu c bảố o v th c vật”, Hà Nội. ệ ự
11. T ạ Thị Thảo (2009), Giáo trình gi ng d y thả ạ ống kê trong hoá phân tích, Trường ĐH Khoa học tự nhiên-ĐH Quốc gia Hà N i ộ
12. T ng c c tiêu chuổ ụ ẩn đo ờlư ng chất lượng TCVN 6910 (2001), Độ chính xác (Độ đúng và độ ch m ) cụ ủa phương pháp đo và kết qu , Nhà xu t b n khoa h c và k ả đo ấ ả ọ ỹ thuật, Hà Nội tr 1-6.
53
13.Trần T ứ Hiếu, T V ng Nghi, Nguyừ ọ ễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003) Hoá học phân tích - Phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xu b n khoa h c và k ất ả ọ ỹ thu t, Hà N i.ậ ộ
14. Tr n Vi t Hùng (2006), ầ ệ Khảo sát và nghiên cứu phân tích dư lượng m t s hóa ch t ộ ố ấ b o v ả ệ thực vật trong dược liệu sạch, Lu n án tiậ ến sĩ, Trường đại học dược Hà Nội.
Tiếng Anh
15. AgilentTechnologies. (2006-2007) , Agilent 6410 Triple Quad LC/MS System
http://www.chem.agilent.com
16. AgilentTechnologies. (2006), Agilent 6410 Triple Quad LC/MS Familiarization Guide
http://www.chem.agilent.com/
17. AgilentTechnologies. (2006), Automated Screening of 600 Pesticides in Food by LC/TOF MS Using a Molecular-Feature Database Search, 5989-5496EN
http://www.chem.agilent.com/enUS
18. AgilentTechnologies QuEChERS Demo
http://www.agilent.com/QuEChERS.
19. Anastassiades, M., Lehotay, S.J., Stajnbaher, D., & Schenck, F.J. (2003), "Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and dispersive solid-phase extraction for the determination of pesticide residues in produce", Journal of AOAC International, 86(2), 412 431. –
20. Anastassiades, M., Mastovska, K., & Lehotay, S.J. (2003), "Evaluation of analyte protectants to improve gas chromatographic analysis of pesticides", Journal of Chromatography A, 1015(1), 163 184. –
21.AOAC International (1985), “AOAC Official Met hod 985.22 Organochlorine and Organophosphorus Pesticide Residues - Gas Chromatographic Method” AOAC Official method.
22. AOAC International (1988), “AOAC Official Method 998.01 Synthetic Pyrethroids in
Agricultural Products - Multiresidue Gas Chromatographic Method” AOAC Official method.
54
23 AOAC International (2012), “AOAC Official Method 2007.01 – Pesticide residues in foods by acetonitrile extraction and partitioning with magnesium sulfate” Official Method of Analysis of AOAC International, 19th edition, AOAC, USA.
24. AOAC International (2012), “AOAC Official Method 985.22 – Organochlorine and organophosphorus pesticide residues gas chromatographic”, Official Method of Analysis of AOAC International, 19th edition, AOAC, USA.
25. AOAC International (2012), “ Appendix F: Guidelines for Standard Method
Performance Requirements”, Official Method of Analysis of AOAC International, 19th edition, AOAC, USA.
26. Angelika, Gratzfeld-Husgen and Rainer Schuster. (2001), HPLC for Food Analysis, Germany, Publiccation Number 5988-3294EN, 101 105 –
27. CDS Tamlin. 2003, The Pesticide Manual Third Edition, Harcourt College Publishers, NewYork pp 508-509.
28. Donal L. Pavia, Gary M. Lampman, Georges S. Kriz. (2001), Introduction to spectrometry. A guide for student of organic chemistry, Harcourt College Publishers, NewYork, London, Tokyo
29. Dr. Tuija Pihlström, Dr. Michelangelo Anastassiades, Mr. Arne Andersson, Dr. André de Kok, Dr. Mette Erecius Poulsen, Dr. Amadeo R. Fernández- ba. (2009), Al
Method Validation and quality control procedure for pseticide residue analysis in food and feed, Document No. SANCO/10684/2009,
http://ec.europa.eu/food/plant/protection/resources/qualcontrol_en.pdf
30. European Commission (2002), “2002/657/EC: Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results”.
31. EN 15662 (2008), Food of plant origin – Determination of pesticide residues using GC-MS and/or LC-MS/MS following acetonitrile extraction/patitioning and cleanup buy dispersive SPE QuEChERS method. – –
32. Environmental Protection Agency. (1995). http://www. EPA. Gov
33. Food and Agriculture Organization of the United Nations (2002 ),International Code of Conduct on the Distribution and Use of Pesticides
55
34. Frederick M. Garfiled, Eugenne Klesta, Jerry Hirsch. (2000), Quality assurace principles for analytical laboratories, USA.
35. Huanpu E. Deen P.E. (2008), Quality Muanual and Quality Procedures for ANSI/ISO/IEC 17025, Harcourt College Publishers, NewYork, -4038
36. Kim A. Anderson, Ph.D. (1999), Analytical Techniques for Inorganic Contaminants, USA.
34.Lehotay S.J. (2007), J. AOAC. Int. 90, 485 – 520.
37. Marvin McMaster and Chiristopher MsMaster. (1998), GC/MS A Practical User’s Guide, United States of Amerrica, 40 -50
38. Michelangelo Anastassiades, CVUA Stuttgart. (2003), QuEChERS - A Mini- Multiresidue Method for the Analysis of Pesticide Residues in Low-Fat Products. http:\\www.quechers.com
39. Newzealand food safety authority. (1999), Maximum residue limits (MRLs) for specified AgricultAral compound in food. Proposed amendment to the Newzeland (MRL of agricultural compounds) mandatory food standard, 1999.http://www.nzfsa.govt.nz/acvm/publications/agvetlink/issue-24/article7. htm
40. T. Visser, M J Verdenbregt and A.P J Mde Jong, L.A. van Ginkel, H.J. vanRossurn
and R.W. Stephany. Cryotrapping gas chromatography fourier trasform infrared –
spectrometry: anew technique to confirm the presence of beta – agonists in animal material. Analytica Chumuca Acta, 275, 205-214.
41. Tethgatuk P., Jinsart W. and Arnold P. (2001), Determination of Organophosphate Pesticides in Vegetable Farm Drained Water Using Solid Phase Extraction Followed by High Performance Liquid Chromatography, J. Sci. Res. Chula. Univ, Vol. 26 No. 1, 35-47 42. Reigart, J.R., & Roberts J.R. (1999), Recognition and Management of Pesticide Poisonings, 5thedition, United State Environmental Protection Agency, Washington DC.
56 PHỤ LỤC
Phụ lục 1 : Một số sắc ký đồ phân tích mẫu
Hình 3.7: Sắc ký đồ EIC và phổ khối của Acetamiprid ở nồng độ 20 ng/ml
57
Hình 3.9: Sắc ký đồ EIC và ph ổ khối của Buprofezin nở ồng độ 10 ng/ml
Hình 3.10 S: ắc ký đồ EIC và ph kh i cổ ố ủa Chlorothalonil nở ồng độ 40 ng/ml
58
Hình 3.11: Sắc ký đồ EIC và phổ khối của exacH onazo le ở nồng độ 10 ng/ml
59
Phụ lục 2. Một số đường chuẩn được xây dựng trong nghiên cứu
Hình 3.13: Đường chuẩn Acetamiprid
60
Hình 3.15: Đường chuẩn Chlorothalonil
61
Hình 3.17: Đường chuẩn exacH onazo le