2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu
M u è khô ẫ ch được ửx lý theo quy trìnhQuEChERS đã nghiên cứu:
- Cân 10 gam/m u ẫ đã được c nh ắt ỏ và đồng nh t vào ng tuyp ly tâm lo i 50ml có ấ ố ạ n p kín. ắ Th m 10 ml nướê c c t và ngâấ m trong vòng 2 gi . ờ
- Thêm 10 ml acetonitril (ACN) rung l c m nh kho ng 2 ắ ạ ả – 3 phút. Sau đó thêm 4 MgSO4, 1 g NaCI, h n h p muỗ ợ ối đệm citrat 1 g Na3C6H5O7 và 0,5 g Na2C6H6O7 , đo pH mẫu đạt 5 -5,5.
- Rung lắc mạnh 2-3 phút và ly tâm 3000vòng/phút trong 5 phút để pha h u cữ ơ được phân tách. Hút 4 ml pha hữu cơ và thêm các chấ ất h p ph PSA, 1g MgSOụ 4, l c kho ng 30 ắ ả giây. Ti n hành ly tâm l n n a, thu l y pha hế ầ ữ ấ ữu cơ, thêm 5% axit fomic vào 2ml dịch chiết rồi phân tích b ng ằ LC-MS/MS
32
Hình 2.1: Quy trình phân tích mẫu 2.3.2. Điều kiện phân tích
2.3.2.1. Điều kiện phân tách trên hệ thống HPLC
Cột phân tích : ZORBAX SB RPC18 150mm x 4,6 mm, 5 m - Nhiệ ột đ cột : 400C
- T c dòng : 0,6 ml/phút ố - Th ể tích bơm mẫu : 20 l
M u (>1kgẫ ) được ắc t nh ỏ ra, lấy kho ng 200g mả ẫu đại diệ và đồn ng nhất bằng thiết bị đồ ng nhất mẫu
Chuyển 10g m u ẫ đã đồng nh t vào ng ly tâm 50ml. Thêm 10 ml ấ ố n c c t và ngâm trong 2 giướ ấ ờ
Thêm 10ml ACN +1g Na3C6H5O7 .1,5 H2O + 1 g NaCl + 0,5 g Na2C6H6O7. 2H2O +4 g MgSO4
Lắc mạnh trong kho ng 2-3 ả phút, sau đó ly tâm với tốc độ 3000 vòng /phút và trong 5 phút
Chuyển 4ml vào ng ly tâm 15ml ố trong đó đã có 100mg MgSO4+30 mg PSA/ml d ch chi t và lị ế ắc trong khoảng 30 giây
Ly tâm 3000 vòng/phút trong kho ng 5 phútả
Chuyển 2 dml ch chi t vào vial 2 ml và thêm 5% acid formic và l c ị ế ắ đều
33
Chương trình dung môi như sau: tỷ ệ l kênh %A: %B = 65: 35, trong th i gian 12 phút/ ờ m u. ẫ
2.3.2.2. Điều kiện phân tích trên hệ thống khối phổ ESI - MS/MS : Nguồn ion hóa (ESI) áp d ng các thông s ụ ố như bảng 2.1 Nguồn ion hóa (ESI) áp d ng các thông s ụ ố như bảng 2.1
Bảng 2. : Các thông số1 của chế độ ion hóa ESI Nguồn ion hóa: ESI/ posetive/MRM Nhiệ ột đ khí N2: 300 oC
Lưu lượng khí N2: 7 L/phút Áp suấ ầt đ u phun: 20 psi Điện áp mao qu n: ả 4000 V
Chế độ quét MS/MS:MRM (SIM to SIM) v i các thông s ớ ố như bảng 2.2 Bảng 2. : Các thông số chế độ quét MS/MS2 Hoạt chất Thời gian
lưu (phút) Ion sơ c p ấ Ion thứ ấ c p Chu kỳ quét (ms) Điện áp phân m nh ả (V) Năng lượng va ch m ạ (V) Acetamiprid 2.98 223.1 126.3 40 90 17 56.4 40 90 9 Acephate 2.89 184 143.1 40 90 4 122.7 40 90 17 Buprofezin 5.09 306.2 116.1 40 90 9 57.2 40 90 17 Chlorothalonil 2.20 244.8 246.8 90 90 8 181.8 90 90 8 Fipronil 3.29 434.9 329.7 90 90 25 249.9 90 90 25 Hexaconazo le 3.98 314.1 159 40 100 10 70.1 40 100 10 Profenofos 4.36 372.9 302.9 40 100 13 97 40 100 13
34
2.3.3. Thẩm định xác định giá trị sử dụng của phương pháp2.3.3.1. Tính chọn lọc, đặc hiệu 2.3.3.1. Tính chọn lọc, đặc hiệu
Tính đặc hi u: là kh ệ ả năng phát hiện được ch t phân tích khi có m t các t p chấ ặ ạ ất khác như các tiền ch t, các ch t chuy n hóa, các chấ ấ ể ất tương tự ạ, t p chất… Cụ ể th , trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh được k t qu ế ả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng th i k t qu ph i là âm tính khi có m t ờ ế ả ả ặ các c u trúc khác g n gi ng ch t phân tích. Trong phép phâấ ầ ố ấ n tích định lượng là kh ả năng xác định chính xác ch t phân tích trong m u khi b ấ ẫ ị ảnh hưởng c a t t c các y u t khác, ủ ấ ả ế ố nhằm hướng đến k t qu ế ả chính xác. Tính đặc hiệu thường liên quan đến việc xác định ch ỉ một chất phân tích.
Tính ch n l cọ ọ : Là khái ni m rệ ộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến vi c phân tích ệ m t s ho c nhi u ch t chung m t qui trình. N u ch t cộ ố ặ ề ấ ộ ế ấ ần xác định phân bi t rõ v i chệ ớ ất khác thì phương pháp phân tích có tính chọ ọc. Như vận l y, tính ch n l c có th bao trùm ọ ọ ể c ả tính đặc hiệu. Do các phương pháp phân tích thường có nhi u ch t cùng xu t hi n nên ề ấ ấ ệ khái ni m tính ch n lệ ọ ọc thường mang tính khai quát hơn.
*Cách xác định:
Có nhiều cách xác định tính đặc hi u, tính ch n l c, trong nghiên c u này do thiệ ọ ọ ứ ết b s c ký có g n detecter MS nên chúng tôi so sánh ph c a ch t phân tích trên 3 m u: ị ắ ắ ổ ủ ấ ẫ m u tr ng, m u chu n và m u thêm chu n. M u trẫ ắ ẫ ẩ ẫ ẩ ẫ ắng không được lên tín hi u ch t phân ệ ấ tích, m u thêm chu n ph i có tín hi u ch t phân tích t i thẫ ẩ ả ệ ấ ạ ời gian lưu tương ứng th i gian ờ lưu trên mẫu chu n. ẩ
2.3.3.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
Giới h n phát hi n LOD: là nạ ệ ồng độ mà tại đó giá trị xác định đượ ớn hơn độc l không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ ấ th p nh t c a ch t phân tích trong ấ ủ ấ m u có th phát hiẫ ể ện được nhưng chưa thể định lượng được.
Có nhiều các xác định LOD: dựa trên độ ệ l ch chu n, d a trên ẩ ự đường chu n, dẩ ựa trên t l tín hi u nhi u. Trong nghiên cỷ ệ ệ ễ ứu này chúng tôi xác định LOD d a trên t l tín ự ỷ ệ hi u nhiệ ễu đường (S/N): Phân tích m u thêm chu n nẫ ẩ ở ồng độ thấp còn có th xu t hi n ể ấ ệ
35
tín hi u c a ch t phân tích. ệ ủ ấ Xác định t l tín hi u chia cho nhi u (S/N = Signal to noise ỷ ệ ệ ễ ratio).
trong đó: S là chi u cao tín hi u cề ệ ủa chất phân tích N là nhiễu đường n n ề
LOD được ch p nh n t i nấ ậ ạ ồng độ mà tại đó tín hiệ ớu l n g p 3 l n nhi u (S/N = 3). ấ ầ ễ : là n t i thi u c a m t ch t có trong m u th Giớ ạn định lượi h ng LOQ ồng độ ố ể ủ ộ ấ ẫ ử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho k t qu ế ả có độ ch m mong mu n. ụ ố
Có nhiều cách xác định LOQ trong nghiên cứu này chúng tôi cũng xác định dựa trên t l tín hi u nhiỷ ệ ệ ễu S/N. LOQ được ch p nh n t i nấ ậ ạ ồng độ mà ại đó tín hiệ ớ t u l n gấp 10 l n nhi u (S/N = 10). ầ ễ
2.3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuy n tính c a mế ủ ột phương pháp: là kho ng nả ồng độ ở đó có sự ph thuụ ộc tuyến tính gi a đ i lưữ ạ ợng đượ đo và nồng độc các ch t phân tích. ấ
Đường chu n: ẩ là đường bi u di n s ph ể ễ ự ụ thộc tuy n tính giế ữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích.
Để xác định kho ng tuy n tính chúng tôi th c hiả ế ự ện đo các dung dịch chu n có ẩ nồng độ thay đổ ừi t và kh o sát s ph thu c c a tín hi u vào nả ự ụ ộ ủ ệ ồng độ. Sau đó vẽ đường cong ph ụ thuộc gi a diữ ện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát s ph thuự ụ ộc cho đến khi không còn tuy n tính ế
Sau khi xác định được kho ng tuy n tính c a các chả ế ủ ất, chúng tôi đã xây dựng đường chu n trên n n m u th c có s d ng n i chu n, nh m mẩ ề ẫ ự ử ụ ộ ẩ ằ ục đích loại tr ừ ảnh hưởng c a n n mủ ề ẫu đến k t qu phân tích. N i chuế ả ộ ẩn được thêm vào dung d ch chuị ẩn để đo máy, v i nớ ồng độ phù h p và gi ng nhau. V ợ ố ẽ đường cong ph thu c gi a t l tín hiụ ộ ữ ỷ ệ ệu chất ngo i chu n và chia cho n i chu n (tr c tung y) ph thu c vào nạ ẩ ộ ẩ ụ ụ ộ ồng độ ngo i chu n ạ ẩ (trục hoành x).
2.3.3.4. Độ lặp lại (độ chụm) và độ thu hồi (độ đúng).
Hiện nay có nhi u cách khác nhau v thu t ng ề ề ậ ữ độ chính xác. Theo quan điểm m i ớ nh t c a tiêu chu n qu c t (ISO 5725 1- 6:1994) và tiêu chu n qu c gia (TCVN 6910 1-ấ ủ ẩ ố ế ẩ ố
36
6:2005) thì thu t ng ậ ữ độ đúng và độ chụm di n t chính xác cễ ả độ ủa phương pháp phân tích.
Độ chụm hay độ ặ ạ l p l i là mức độ ầ g n nhau c a các giá tr riêng l củ ị ẻ ủa các phép đo l p lặ ại. Độ chụm là m t khái niộ ệm định tính và được bi u diể ễn định lượng bằng độ ệ l ch chuẩn S hay h s bi n thiên Rệ ố ế SD (%):
( ) 1 1 2 − − = = N x x S N i i (2-1) RSD (%) = .100 x S (2-2) Trong đó:
xi : Nồng độ tính được của lần th nghiử ệm thứ i
x : Nồng độ trung bình tính được của N lần th nghiử ệm. N : S l n th nghiố ầ ử ệm.
Độ đúng là mức đ g n nhau c a giá tr phân tích v i giá tr th c ho c giá tr ộ ầ ủ ị ớ ị ự ặ ị được chấp nhận. Độ đúng là khái niệm định tính và được biểu diễn định lượng d i dạng độ ướ chệch (Bias) hoặc hiệu su t thu h i (recoverấ ồ y)
R(%) = CC
c .100 -3) (2 Trong đó:
R: độ thu hồi (%)
C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/ml). Cc: Nồng độ chu n thêm (lý thuy t) (ng/ml). ẩ ế
Để ác định độ x chụm và độ đúng của phương pháp phân tích, chúng tôi ti n hành ế thí nghiệm như sau: Tiến hành thí nghi m l p l i trên n n m u tr ng thêm chu n 3 mệ ặ ạ ề ẫ ắ ẩ ở ức nồng độ khác nhau (mỗi mức làm lặ ại p l 10 l n) và tính toán k t qu ầ ế ả theo công thức trên.
37
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích dư lượng 7 HCBVTV3.1.1. Tối ưu hoá các điều kiện đo trên thiết bị HPLC – MS/MS 3.1.1. Tối ưu hoá các điều kiện đo trên thiết bị HPLC – MS/MS
3.1.1.1. Khảo sát các điều kiện hệ thống HPLC3.1.1.1.1. Chọn điều kiện bơm mẫu 3.1.1.1.1. Chọn điều kiện bơm mẫu
V i h ớ ệ thống HPLC MS/MS 6410MS (Agilent), b ph– ộ ận bơm mẫu là t ự động (Auto Sampler). Mẫu đã chuẩn bị ạ n p vào ống 2ml đặt trong khay, sau đó cánh tay roboot s hút chính xác và n p m u vào vòng m u b ng 1 xi lanh áp su t cao, sau nh h ẽ ạ ẫ ẫ ằ ở ấ ờ ệ thống chuy n van mà mể ẫu được dòng pha động n p vào cạ ột tách.
Để phù h p c u hình máợ ấ y và đạt được yêu c u v ầ ề độ chính xác, độ ặ ạ ủ l p l i c a thi t ế b , chúng tôi ch n th ị ọ ể tích bơm mẫu là 20 µl vì khi đó sai số ằ n m trong gi i h n ki m soát ớ ạ ể (theo nhà s n xu t ), không ả ấ ảnh hưởng đến thành phần dung môi pha động. Lượng cơ chất thực v t và HCBVTV trong m u v n n m trong gi i hậ ẫ ẫ ằ ớ ạn cho phép đố ới v i kh ả năng phân giải của cột tách (theo phương pháp tách chiết ).
Toàn bộ các mẫu trên khay được ổn nhi t tại 10ệ 0C và thời gian bảo quản mẫu < 24h. 3.1.1.1.2. Chọn cột tách
C t tách góp m t ph n khá quan tr ng trong vi c quyộ ộ ầ ọ ệ ết định quá trình tách có độ phân gi i tả ốt hay không. Để chọn lo i cạ ột có pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào c u trúc ấ phân t ử và độ phân c c c a ch t phân tích. Vự ủ ấ ới đối tượng c n tách là ầ 7 HCBVTV đều có
tính ch t tan tấ ốt trong nước, pha động phân c c nên c t tách s d ng ph i là c t pha ự ộ ử ụ ả ộ ngược. Trong nghiên c u này chúng tôi s d ng c t Agilent ZorbaxSB C18 v i các thông ứ ử ụ ộ ớ s cố ột như sau:
ZorbaxSB C18 (150mm × 4.6mm × 5µm) hoặc tương đương Nhiệ ột đ cột: 400C
3.1.1.1.3. Khảo sát thành phần pha động và chế độ chạy
Pha động và pha tĩnh là hai yếu t tr c ti p ố ự ế ảnh hưởng tới điều ki n tách s c ký. ệ ắ Việ ực l a chọn pha động r t quan trấ ọng vì pha động có th ể ảnh hưởng tới độ ch n l c c a ọ ọ ủ
38
HCBVTV trong nghiên c u tan tứ ốt trong nước và căn cứ giá thành đề tài đã chọn h dung ệ môi là nước và acetonitril 5 [2 ].
3.1.1.1.4. Khảo sát tốc độ dòng pha động
Tốc độ dòng pha động liên quan đến quá trình thi t l p cân b ng c a ch t tan trong ế ậ ằ ủ ấ hai pha tĩnh và pha động. Khi tốc độ pha động nh , ch t phân tích ra mu n, gây doãng ỏ ấ ộ chân pic, giảm độ nh y và tạ ốn dung môi. Ngượ ạc l i, khi tốc độ pha động quá l n có th ớ ể làm cho các ch t trong h n h p mấ ỗ ợ ẫu chưa kịp tách ra kh i nhau, dỏ ẫn đến hiện tượng chồng pic và gây áp su t lớn trong bơm [14 ấ ].
Trong ch ế độ chạy tr n dung môi, khi c nh ch ộ ố đị ế độ đo phần MS/MS b ng cách ằ tăng dầ ỷ ện t l ACN và thay đổ ốc độ pha đội t ng các m c:0,5; 0,6; 0,7 ; 0,8 ; 0,9 và 1 ở ứ ml/phút căn cứ độ ẹp pic, độ h cân x ng cứ ủa pic để ự l a ch n. Th c nghi m cho th y t i t ọ ự ệ ấ ạ ỷ l ệ thể tích c a hai kênh A và kênh B là 65% : 35%, tủ ốc độ dòng là 0,6 ml/phút píc thu được nh n, họ ẹp và cân đối.
Hình 3.1: Sắc ký tổng ủa ácc c HCBVTV
Chúng tôi nh n th y tậ ấ ốc độ dòng th c nghi m (0,6 ự ệ ml/phút) nh ỏ hơn so mức khuyến cáo c a nhà s n su t ủ ả ấ (1 ml/phút). Nhưng điều này là phù hợp vớ ệ thối h ng HPLC-MS/MS vì tốc độ dòng thấp sẽ thu n lậ ợi cho quá trình hóa hơi dung môi, tách và ion hóa hoạt chất phân tích của nguồn ion hóa ESI.
39
Bảng 3. Điều kiện tốc độ dòng pha động để tách hỗn hợp HCBVTV1. Thời gian
(phút)
Tốc độ dòng
(mL/phút) Kênh A Kênh B
0-7 0,6 65 35
3.1.1.2. Khảo sát các điều kiện khối phổ MS/MS
Để phân tích HCBVTV bằng sắc ký lỏng khối phổ MS/MS cần phải xác định được ion phân tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) của HCBVTV. Với nguồn ion hóa ESI, chế độ ion dương các ion phân tử thường được tạo thành bằng cách thêm một proton vào khối lượng phân tử của chất đó. Dựa vào khối lượng phân tử của các HCBVTV, trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu trước đây trên thế giới, chúng tôi đã xác định được các ion phân tử của từng HCBVTV (bảng 2.2 ).
Tuy nhiên, để định tính và định lượng cần phải xác định được ion sản phẩm của từng HCBVTV. Sử dụng kim tiêm mẫu 20 µl tiêm trực tiếp các chất chuẩn HCBVTV có nồng độ 100 ng/ml vào MS để xác định hai ion con ứng với từng chất. Ion con có tín hiệu lớn hơn được sử dụng để làm ion định lượng, ion con có tín hiệu thấp hơn được dùng cho mục đích xác nhận (khẳng định). Các thông số bắn phá như Dwell time (Chu kỳ quét), Fragmentor (Điện áp phân mảnh), và CE (năng lượng va chạm) được tối ưu tự động theo thiết bị MS. Các kết quả được tổng hợp ở bảng 2.2.
Bảng 3. Điều kiện tối ưu cho thiết bị HPLC –2: MS/MS
HPLC MS/MS
T l kênh A : B = 65% 35% ỷ ệ : Chế độ ion hóa : ESI-posetive và negative
Tốc độ dòng : 0,6 ml/phút Chu kỳ quét : theo bảng 2.2 Áp suấ ầt đ u phun :4000V Điện thế phân mảnh : theo bảng 2.2
40
3.1.2. Nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp3.1.2.1 Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp