Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme và hoạt tính enzyme, song đặc điểm và các tính chất sinh lý sinh hoá của vi sinh vật có ý nghĩa quyết định hơn cả. Chính vì vậy, việc tuyển chọn các chủng hoạt động bằng cách phân lập vi sinh vật từ các nguồn khác nhau là vô cùng quan trọng. Với mục tiêu tìm kiếm nấm mốc sinh enzyme xylanase bền nhiệt và hoạt động ở pH thấp, chúng tôi tiến hành lấy mẫu có bản chất lignocellulose từ nhiều nguồn khác nhau, chủ yếu là xác thực vật bị phân huỷ: rơm mục, cây cỏ mục, các giá thể trồng nấm, mùn cưa … giữa các đống ủ hữu cơ hoặc bãi rác để tìm được các chủng chịu nhiệt, trên các địa bàn như Bắc Ninh, Hà Nội, Hải Phòng, Quảng Ninh, Thái Nguyên, Đắc Lắc. Mẫu thu thập được bảo quản ở nhiệt độ 4C và được phân lập như trong phần phương pháp.
Mẫu được pha loãng bằng dung dịch NaCl 0.9% pH 2.0, và phân lập trên môi trường Czapeck Dox Agar pH 2.0 với mục đích chọn lọc những loài nấm mốc chịu pH thấp. Chúng tôi đã tiến hành nuôi đồng thời ở hai nhiệt độ 30°C và 50°C. Tuy nhiên chỉ những đĩa petri nuôi ở 30°C mới xuất hiện khuẩn lạc, những đĩa nuôi ở 50°C không thấy xuất hiện khuẩn lạc. Có lẽ môi trường pH thấp và điều kiện nhiệt độ cao là môi trường quá khắc nghiệt với nấm mốc trong các mẫu phân lập.
Khi tiến hành phân lập đồng thời ở pH 2.0 và pH 5.0 ở 30°C, quan sát thấy khuẩn lạc trên các đĩa phân lập ở pH 2.0 có số lượng ít, đường kính nhỏ, bề mặt nhăn, bám rất chắc vào môi trường. Trong khi đó, khuẩn lạc trên các đĩa phân lập ở pH 5.0 có số lượng lớn, đường kính to hơn, bề mặt bông xốp, không bám nhiều vào môi trường.
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 48 Lê Thị Thùy Linh
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường Czapeck pH 2.0 (trái), pH 5.0 (phải) Từ 30 mẫu, chúng tôi đã phân lập được 62 chủng nấm mốc. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1 dưới đây.
Bảng 3.1. Danh sách các chủng nấm mốc chịu pH đã phân lập được
STT Đặc điểm mẫu Địa điểm lấy mẫu Kí hiệu chủng nấm
mốc phân lập đƣợc
1 Rơm mục, đáy đống ủ, màu nâu đen Tiên Du, Bắc Ninh LPH 001, LPH 002 2 Thân gỗ mục, giữa đống ủ, màu xám Lĩnh Nam, Hoàng Mai, Hà
Nội
LPH 003, LPH 004, LPH 005, LPH 006 3 Lá cỏ mục, giữa đống ủ, màu xanh đen Lĩnh Nam, Hoàng Mai, Hà
Nội
LPH 007, LPH 008, LPH 009, LPH 010 4 Cỏ mục, giữa đống ủ, màu nâu đen Lĩnh Nam, Hoàng Mai, Hà
Nội LPH 011, LPH 012
5 Thân mồng tơi mục, giữa đống ủ, màu xanh đen
Lĩnh Nam, Hoàng Mai, Hà
Nội không lấy chủng nào
6 Rơm trồng nấm mỡ đã mục, trên bề
mặt, màu nâu đen Viện di truyền nông nghiệp LPH 013, LPH 014 7 Rơm trồng nấm mỡ đã mục, ở giữa,
màu nâu đen Viện di truyền nông nghiệp
LPH 015, LPH 016, LPH 017, LPH 018 8 Mùn cưa trong bịch trồng nấm, có mốc
xanh, bề mặt Viện di truyền nông nghiệp LPH 019
9 Mùn cưa trong bịch trồng nấm, có mốc
trắng, ở giữa Viện di truyền nông nghiệp LPH 020 10 Mùn cưa trong bịch trồng nấm, có mốc
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 49 Lê Thị Thùy Linh
STT Đặc điểm mẫu Địa điểm lấy mẫu Kí hiệu chủng nấm
mốc phân lập đƣợc
11 Lá mục trong rừng, màu nâu đen Buôn Hồ, Đắc Lắc LPH 022, LPH 023, LPH 024
12 Cành gỗ mục trong rừng, màu nâu Buôn Hồ, Đắc Lắc LPH 025, LPH 026, LPH 027
13 Vỏ cà phê mục, giữa đống ủ, màu nâu Buôn Hồ, Đắc Lắc LPH 028, LPH 029, LPH 030
14 Mùn cưa mục, giữa đống ủ, màu đen Trại nấm Yên Nghĩa LPH 031, LPH 032 15 Rơm mục, đáy đống, màu nâu Mỹ Hưng, Mỹ Lộc, Nam
Định
LPH 033, LPH 034, LPH 035
16 Trấu mục được vùi dưới đất, màu nâu đen
Mỹ Hưng, Mỹ Lộc, Nam Định
LPH 036, LPH 037, LPH 038
17 Trấu mục + phân gà, giữa đống ủ phân Mỹ Hưng, Mỹ Lộc, Nam Định
LPH 039, LPH 040, LPH 041, LPH 042 18 Gỗ mục trên cây, màu vàng nâu Mỹ Hưng, Mỹ Lộc, Nam
Định LPH 043, LPH 044
19 Rơm mục + phân bò, màu đen, ướt Hưng Lộc, Mỹ Lộc, Nam Định
LPH 045, LPH 046, LPH 047
20 Rơm mục, đáy đống, màu đen, ướt Hưng Lộc, Mỹ Lộc, Nam Định
LPH 048, LPH 049, LPH 050
21 Rơm mục, ướt, màu nâu đen Yên Giang, Quảng Yên,
Quảng Ninh không lấy chủng nào 22 Rơm mục, màu nâu đen Hà Nam, Quảng Yên,
Quảng Ninh LPH 051, LPH 052
23 Vỏ trấu và phân gà, màu vàng nâu, tơi xốp
Tân An, Quảng Yên,
Quảng Ninh LPH 053
24 Cành lá mục trong rừng, màu nâu đen Định Hóa, Thái Nguyên không lấy chủng nào 25 Trấu, giữa đống ủ, màu đen, ướt Chương Mỹ, Hà Nội LPH 054, LPH 055 26 Cành mục, có mốc trắng, trong rừng Đồ Sơn, Hải Phòng LPH 056
27 Vỏ gỗ mục, có mốc trắng, trong rừng Đồ Sơn, Hải Phòng LPH 057 28 Lá thông mục trong rừng thông, màu
nâu đen Đồ Sơn, Hải Phòng
LPH 058, LPH 059, LPH 060
29 Lá mục, màu nâu Đồ Sơn, Hải Phòng không lấy chủng nào
30 Rễ cây mục, màu nâu Đồ Sơn, Hải Phòng LPH 061, LPH 062
Các chủng nấm mốc đã thuần được nuôi cấy 1-2 ngày trên môi trường thạch đĩa PDA có hình thái phân hóa rõ ràng và đa dạng. Chúng tôi tiến hành làm tiêu bản quan
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 50 Lê Thị Thùy Linh
sát hình thái tế bào của các chủng dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 20X, 40X và chụp lại với bằng phần mềm IC Capture. Dưới đây là hình ảnh đại diện của một số chủng phân lập được
LPH 005
LPH 022
LPH 035
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 51 Lê Thị Thùy Linh
Sau 2-3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA ở 30°C để làm sạch, qua quan sát ta thấy hình thái và màu sắc khuẩn lạc khá đa dạng: khuẩn lạc xốp, đa số đều có bào tử dễ bay như các chủng LPH 005, LPH 048, LPH 060…chỉ duy nhất chủng LPH 025 không có bào tử, khuẩn lạc có màu xanh, vàng, đen, trắng… Cuống bào tử đính dạng bình không phân nhánh (LPH 005), hoặc phân nhánh (LPH 022) hoặc dạng thẻ phân nhánh (LPH 035). Sau khi làm sạch và giữ trong ống thạch nghiêng, các chủng nấm mốc phân lập được sẽ được tiến hành các thí nghiệm tiếp theo như: xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase và khả năng chịu pH, chịu nhiệt của những enzyme đó, đồng thời sẽ được phân nhóm bằng kĩ thuật fingerprinting và định tên bằng 18s rDNA.