Thông thường tốc độ phản ứng enzyme chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạn xác định, ở giới hạn đó enzyme vẫn còn bền nhiệt chưa bị biến tính. Trong trường hợp xylanase I, chúng tôi tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên phản ứng thủy phân cơ chất xylan hòa tan bởi xylanase I, từ đó xác định nhiệt độ hoạt động tối thích của enzyme. Dịch enzyme sau tinh chế được phản ứng đồng thời ở dải nhiệt độ 30°C, 40°C , 50°C , 60°C , 70°C , 80°C , 85°C , 90°C ở điều kiện pH 5.0. Để khảo
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 74 Lê Thị Thùy Linh
sát độ bền nhiệt của xylanase I, enzyme được pha trong đệm Na-acetate pH 5.0 ủ ở các nhiệt độ khác nhau 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 75°C, 80°C, 90°C, 99°C trong 10 phút. Sau đó tiến hành xác định hoạt tính xylanase còn lại. Kết quả thể hiện trong hình 3.10 a và b.
(a) (b)
Hình 3.10. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính xylanase I. (a): Khảo sát nhiệt độ tối ưu; (b): Khảo sát độ bền nhiệt của xylanase I
Khi phản ứng ở nhiệt độ 30°C-40°C, khả năng xúc tác phản ứng của xylanase giảm lần lượt còn 17.45% và 24.59%, do độ linh động cấu trúc của cơ chất thấp. Khi tăng dần nhiệt độ phản ứng, khả năng xúc tác tăng dần, ở 50°C-60°C hoạt tính của nó đạt 45.23% và 59.93%, hoạt tính của xylanase I tiếp tục tăng ở nhiệt độ 70°C (90% ) và đạt cực đại ở 80°C. Ở nhiệt độ cao hơn (85-90°C), protein bị biến tính nên khả năng xúc tác của enzyme giảm dần và cuối cùng là mất khả năng xúc tác ở nhiệt độ lớn hơn hoặc bằng 90°C. Như vậy, nhiệt độ tối ưu của xylanase I là 70-80°C, đây là kết quả khá khác lạ so với enzyme D-xylanase I cũng được do Cho và cs tinh chế từ chủng Penicillium verruculosum, enzyme này hoạt động tối ưu ở 50-60°C, thấp hơn so với xylanase I [20]. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 30 40 50 60 70 80 90 100 H oạ t tính x yla na se, I U/ l Nhiệt độ (⁰C) 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 H oạ t tính t ƣơng đố i, % Nhiệt độ (⁰C)
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 75 Lê Thị Thùy Linh
Về độ bền nhiệt, hoạt tính xylanase còn xấp xỉ 85 % khi giữ ở nhiệt độ nhỏ hơn 50°C (hình 3.13 b). Khi ủ ở 60°C- 70°C hoạt tính xylanase còn khoảng 75%. Ở nhiệt độ 75°C enzyme vẫn giữa được 50% hoạt tính, nhưng khi ủ ở 80°C hoạt tính enzyme giảm đi rõ rệt khi chỉ còn 2.43% và biến tính hoàn toàn khi nhiệt độ lớn hơn 90°C.
Kết quả thu được về độ bền nhiệt và nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme cho thấy có sự khác biệt rất rõ rệt. Khi xác định nhiệt độ tối ưu ở 80°C enzyme đạt được hoạt tính cao nhất, tuy nhiên khi thử độ bền nhiệt trong 10 phút cũng ở nhiệt độ này thì enzyme lại mất hoạt tính. Điều này có thể lí giải do enzyme được bảo vệ bởi cơ chất và ở 80°C phản ứng diễn ra mạnh mẽ hơn rất nhiêu so với phản ứng ở các nhiệt độ khác nên hoạt tính enzyme đo được ở 80°C khi xác định nhiệt độ tối ưu là cao nhất.
So với các xylanase từ nấm mốc không có nguồn gốc từ môi trường nhiệt cực trị, có khả năng hoạt động cũng như độ bền nhiệt nằm trong khoảng 40-60°C thì Xylanase I từ chủng Penicillium verruculosum có khả năng hoạt động cũng như độ bền nhiệt cao hơn trong khoảng 50-75°C.
Xác định thời gian bán hủy (half-life time)
Một trong những mục tiêu đề tài là tìm kiếm enzyme bền nhiệt do trong công đoạn chế biến hoặc ép viên thức ăn chăn nuôi, nhiệt độ được tăng từ 70-80°C. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn giá trị nhiệt độ khảo sát là 75°C. Enzyme được ủ ở 75°C trong những khoảng thời gian xác định (10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 phút), tiến hành xác định hoạt tính enzyme ở 50°C, pH 5.0 bằng phương pháp DNS. Kết quả thể hiện ở hình 3.11.
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 76 Lê Thị Thùy Linh
Hình 3.11. Khảo sát hoạt tính của enzyme ở 75°C theo thời gian
Thời gian bán hủy (t1/2) được định nghĩa là thời gian mà tại đó hoạt tính giảm đi 50% so với giá trị hoạt tính ban đầu. Dưa vào kết quả phân tích hoạt tính, ta thấy thời gian bán hủy tìm được của xylanase I là 30 phút (còn 57% hoạt tính).