2.2.1. Phƣơng pháp phân lập mẫu tr n ôi trƣờng Czapec pH 2.0
Cân 2 g mẫu vào ống Falcon chứa 18ml dung dịch NaCl 0.9% pH 2.0 đã thanh trùng, lắc đều. Hút 1ml mẫu ở ống Falcon này sang ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 35 Lê Thị Thùy Linh
NaCl 0.9% pH 2.0 đã thanh trùng. Hút 200 µl mẫu từ mỗi ống nhỏ vào đĩa petri vô trùng sau đó rót môi trường Czapek pH 2.0 (đã được làm nóng bằng lò vi sóng) lắc đều rồi chờ cho thạch đông, đem nuôi ở 30°C và 50°C.
Kiểm tra mẫu thường xuyên, quan sát thấy mỗi đĩa thạch có một hoặc nhiều khuẩn lạc nấm mốc khác nhau về hình dạng, màu sắc và kích thước thì tiến hành làm sạch trên môi trường PDA. Lấy mỗi khuẩn lạc khác nhau một vòng que cấy và cấy lên đĩa petri chứa môi trường PDA tương ứng. Sau đó đem nuôi ở nhiệt độ 30°C và 50°C trong 2-3 ngày. Tiến hành làm sạch 2-3 lần đến khi thu được chủng nấm mốc thuần.
Các chủng nấm mốc được nuôi trên đĩa PDA 1-2 ngày sau đó được lấy ra quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc. Làm tiêu bản và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi.
2.2.2. Nuôi cấy và chiết enzyme
Cấy các chủng nấm mốc được bảo quản lạnh trong ống thạch nghiêng PDA sang đĩa PDA nuôi ở 30C trong 2-3 ngày để hoạt hóa giống, giống sau khi được hoạt hóa sẽ được cấy lại vào ống thạch nghiêng PDA, nuôi trong vòng 2-3 ngày ở 30C để giống mọc kín bề mặt thạch, cung cấp giống cho nuôi chiết enzyme.
Cách vào giống:
- Hút 2 ml Tween 80 0.05% (đã thanh trùng) vào ống giống, đốt kĩ que cấy, để nguội bớt rồi cào hết bào tử trong ống, dùng pipet hút toàn bộ dịch giống vào bình tam giác chứa cơ chất đã thanh trùng, đảo đều giống với cơ chất, nuôi trong 7 ngày ở 30°C, mỗi ngày đảo giống 1 lần.
Chiết enzyme:
- Cho 45 ml Na-Citrate 0.05 M, pH 5.0 vào mỗi bình nuôi
- Lắc trong 2 giờ bằng máy lắc, tốc độ 150 rpm/phút
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 36 Lê Thị Thùy Linh
- Giữ lấy phần dịch trong, bảo quản ở -30°C
2.2.3. Xác định hoạt độ enzy e theo phƣơng pháp DNS ở pH 3.0 và pH 5.0
Định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính xylanase (IU) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 μmol D-xylose trong 1 phút ở điều kiện 50°C, pH 5.0.
Cơ chất dùng cho phản ứng là Xylan beechwood 4%.
Nguyên lý: Xylanase (endoxylanase 1,4-β-xylanase) phân cắt cơ chất thành các oligoxylose và xylose có tính khử, có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng [50].
Dựng đường chuẩn
Đường D- xylose được sấy ở 105°C trong 2 giờ. Cân 0.5 g D- xylose hòa tan với 40 ml đệm Na- Citrate 0.05 M pH 5.0 trong cốc đong thủy tinh, sau đó định mức đến 50 ml thu được dung dịch stock 10 mg/ml ở pH 5.0. Thay đệm Na-Citrate 0.05 M, pH 5.0 bằng đệm Glycine-HCl 0.05 M, pH 3.0 sẽ thu được các dung dịch stock 10 mg/ml ở pH 3.0 (bảo quản ở -20°C). Từ đó pha tiếp thành các dung dịch D-xylose với các nồng độ khác nhau như 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1; 1.2 (mg/ml).
Tiến hành xây dựng đường chuẩn:
- Cho vào các ống Eppendorf 0.3 ml dung dịch đường chuẩn
- Bổ sung vào các ống 0.6 ml DNS. Trộn đều, phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0.4 ml dịch phản ứng trộn đều với 1.8 ml nước cất trong cuvet. - Đo OD ở 540 nm.
Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-xylose và giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel thể hiện ở hình 2.1
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 37 Lê Thị Thùy Linh
Hình 2.1. Đường chuẩn xylose theo phương pháp DNS ở pH 3.0 và pH 5.0 Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng D-xylose và giá trị OD540nm là y = 1.147x + 0.0145. Trong đó: x là giá trị OD540nm, y là hàm lượng D-xylose tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0.997 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.
Phân tích hoạt tính xylanase ở pH 3.0
Mẫu thí nghiệm
- Hút 50 µl cơ chất xylan 4% và 150 µl đệm Glycine – HCl 0.05 M, pH 2.55 vào eppendorf (được dung dịch cơ chất xylan 1%, pH 3.0 ), giữ ở 50°C trong 5 phút.
- Bổ sung 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỷ lệ thích hợp), cho enzyme phản ứng với cơ chất ở 50°C chính xác trong 60 phút
- Bổ sung ngay 0.6 ml DNS. Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Ly tâm 10000 rpm trong 1 phút. Lấy 0.2 ml dịch phản ứng trộn đều với 0.9 ml nước cất. - Đo OD 540nm. y = 1.1398x + 0.0303 R² = 0.9971 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 0.5 1 1.5 Nồ ng độ x ylo se ( g/ l) OD 540 nm Đƣờng chuẩn D-xylose ở pH 3.0 y = 1.1342x + 0.0343 R² = 0.9967 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 0.5 1 1.5 Nồ ng độ x ylo se ( g/ l) OD 540 nm Đƣờng chuẩn D-xylose ở pH 5.0
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 38 Lê Thị Thùy Linh
Mẫu đối chứng thí nghiệm: các bước làm giống như mẫu thí nghiệm, tuy nhiên ở bước 2, dịch enzyme đã bị bất hoạt (trước khi phản ứng đun sôi enzyme trong 10 phút). Mẫu blank: Cho vào eppendorf 0.3 ml đệm Glycine – HCl 0.05 M pH 3.0. Gia nhiệt ở 50°C trong 60 phút. Làm tương tự mẫu thí nghiệm từ bước 3 – bước 5.
Mẫu đối chứng dương: phân tích một mẫu enzyme thương phẩm pha loãng 1000 lần bằng đệm Glycine - HCl pH 2.95.
Công thức tính hoạt tính xylanase
FPU= ( )
= ( )
Trong đó:
- Y1: hàm lượng xylose (mg) trong mẫu thí nghiệm - Y0 : hàm lượng xylose (mg) trong mẫu đối chứng - X1: độ hấp phụ của mẫu thí nghiệm
- X0: độ hấp phụ của mẫu đối chứng - a : hệ số góc của đường thẳng y= ax+b - D: hệ số pha loãng
- 0.15: 150/1000 của đường D- xylose khan - 60: thời gian phản ứng
- 0.1: số ml enzyme tham gia phản ứng
- 0.3: tổng thể tích cơ chất và enzyme phản ứng.
Phân tích hoạt tính xylanase ở pH 5.0
Tiến hành giống ở pH 3.0 nhưng enzyme được pha loãng bằng đệm Na-citrate 0.0 5M pH 5.0. Cơ chất được pha xuống nồng độ 1% cũng bằng đệm Na-citrate 0.05 M pH 5.0.
Phản ứng enzyme ở 2 pH khác nhau được tiến hành đồng thời để so sánh tỷ lệ hoạt tính ở pH 3.0 và hoạt tính ở pH 5.0.
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 39 Lê Thị Thùy Linh
2.3.4. Đánh giá độ bền nhiệt của enzyme
- Hút 0.1 ml enzyme vào các ống Eppendorf được đánh số từ 1 đến 4.
- Các ống Eppendorf được đánh số 1, 2 sẽ được để ở nhiệt độ phòng, các ống Eppendorf được đánh số 3, 4 sẽ được để trong bể ổn nhiệt 70°C trong 20 phút. - Sau 20 phút, các ống Eppendorf được lấy ra và cất vào tủ mát, để qua đêm.
- Sau khi để qua đêm, các ống Eppendorf đước đánh số 2, 4 sẽ được đem bất hoạt ở 100°C trong vòng 15 phút rồi làm lạnh bằng nước đá (đây là mẫu đối chứng thí nghiệm).
- Bổ sung 0.1 ml cơ chất xylan 1% vào các ống Eppendorf 1,2,3,4,và đem ủ ở 50°C trong 60 phút để enzyme phản ứng với cơ chất.
- Bổ sung ngay 0.6 ml DNS vào các ống Eppendorf. Đun ở 100°C trong 5 phút để phản ứng màu của DNS xảy ra. Làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0.4 ml dịch phản ứng cho vào cuvet chứa 1.8 ml nước cất, trộn đều. - Đo OD ở 540 nm.
- Mẫu blank: hút 0.3 ml đệm Na-citrate 0.05 M pH 5.0, ủ ở 50°C trong 60 phút. Làm tiếp giống mẫu thí nghiệm từ bước 6- 8.
2.3.5. Phƣơng pháp xác định protein (Lowry)
Nguyên lý: Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy so màu để xác định màu sản phẩm khử của phosphomolipden-phosphowolframate (thuốc thử Folin-Ciocalteau) với phức đồng-protein.
Dựng đường chuẩn:
BSA µg/ml 0 50 100 200 300 400 500
Stock BSA µl 0 5 10 20 30 40 50
Nước cất µl 1000 995 990 980 970 960 950 - Pha stock BSA với nước cất để được các nồng độ BSA như bảng trên. - Cho 0.4 ml BSA + 2 ml thuốc thử C
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 40 Lê Thị Thùy Linh
- Trộn đều và giữ nguyên dung dịch trong 10 phút - Thêm 0.2 ml thuốc thử Folin- ciocalteu
- Trộn đều và giữ nguyên trong 30 phút
- Đo độ hấp phụ quang ở bước sóng λ =660nm
Hình 2.2. Đường chuẩn BSA (theo phương pháp Lowry)
Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng BSA và giá trị OD660nm là y = 0.0019x + 0.0485. Trong đó: x là hàm lượng BSA, y là giá trị OD560nm tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0.9948 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.
Phương pháp phân tích:
- Hút 0.4 ml mẫu vào ống nghiệm cho tiếp 2 ml dung dịch C, lắc đều, giữ nguyên trong 10 phút.
- Thêm 0.2 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu, lắc đều và giữ nguyên trong 30 phút - Đo độ hấp phụ quang ở bước sóng λ =660 nm
- Mẫu Blank: thay 0.4 ml mẫu ở bước 1 bằng 0.4 ml nước cất, rồi làm tương tự như các bước trên.
Công thức tính: Protein (µg/ml) = [(OD – b). E]/a
y = 0.0019x + 0.0485 R² = 0.9948 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 100 200 300 400 500 600 O D 6 6 0 nm Nồng độ BSA, µg/ l
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 41 Lê Thị Thùy Linh
Trong đó E: độ pha loãng của mẫu, b: hệ số tự do của đường chuẩn, a: hệ số góc của đường chuẩn.
2.3.6. Phƣơng pháp điện di protein SDS-PAGE
Chuẩn bị mẫu:
Enzyme được làm sạch qua cột Hitrap Desalting để loại các phân tử có kích thước nhỏ như đường, muối… Sau khi làm sạch, enzyme được trộn với sample buffer 5x theo tỷlệ 4:1. Lắc đều và gia nhiệt 3 phút ở 100°C sau đó làm lạnh nhanh bằng nước đá.
Chuẩn bị gel:
Sau khi lắp kính thật khít, cài lược vào khuôn và đánh dấu bên ngoài để mép gel cách chân lược khoảng 0.4 cm, đổ lớp separating gel đến mức đánh dấu rồi cho ngay 1 lớp nước cất lên bề mặt. Chờ 30 phút để lớp gel tách đông, đổ nước cất đi, gắn lược và đổ tiếp lớp gel cô, chờ 30 phút để gel đông. Đặt bản gel vào buồng điện di, đổ dung dịch điện giải 1x đến vạch quy định của thiết bị, gỡ lược, loại bỏ các mẩu gel thừa bên trên giếng để giếng sạch, khi load mẫu sẽ dễ dàng hơn.
Nạp mẫu:
Mẫu đã chuẩn bị ở trên được load vào giếng với thể tích thích hợp. Đánh dấu thứ tự các giếng vào sổ để phân biệt được các mẫu. Chạy 120 V. Khi mẫu chạy cách mép dưới của gel còn 0.5 cm nữa thì dừng máy. Lấy gel ra khỏi máy và tiến hành nhuộm gel.
Tiến hành nhuộm gel:
- Nhuộm gel trong 50 ml Coomassie brilliant blue ở 50°C trong 1 giờ hoặc lâu hơn để Coomassie brilliant blue bắt màu với protein.
- Tẩy màu bằng dung dịch tẩy I ở 50°C trong 30 phút, lặp lại 2 lần mỗi lần 50 ml. - Ngâm gel trong 100 ml dung dịch tẩy II ở nhiệt độ thường, kèm theo lắc tới khi
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 42 Lê Thị Thùy Linh
2.3.7. Tách chiết DNA tổng số
- Nấm mốc được nuôi 2 ngày trên môi trường PDA.
- Dùng que cấy thu sinh khối nấm mốc cho vào ống ống Eppendorf có chứa 750 µl SSC 2x để loại bỏ protein và RNA. Sau đó đem đun ở 100°C trong 10 phút và ly tâm 12000 rpm trong 1phút ở 20°C.
- Bỏ dịch, giữ phần sinh khối, thêm vào 750 µl nước cất để rửa sạch tế bào và ly tâm 12000 rpm trong 1 phút ở 10°C. Bỏ phần dịch và giữ lại phần sinh khối.
- Dùng que cấy chuyển phần sinh khối này sang ống ống Eppendorf mới có chứa hạt thủy tinh (đường kính 0.2 – 0.5 mm, Roth) và 150 µl phenol: chloroform (tỉ lệ 1:1) và 100 µl nước cất.
- Đưa vào máy phá tế bào trong 2 phút. Sau đó li tâm ở 12000 rpm trong 10 phút ở 10°C.
- Sử dụng kit Silica Bead DNA gel extraction (Thermo Scientific) gồm: Binding Buffer, Silica và Washing buffer để tinh chế DNA. Pha 150 µl Binding Buffer với 0.5 µl Silica được dịch silica milk sử dụng để tinh sạch DNA.
- Lấy 150 µl silica milk trộn đều với 50 µl phần dịch trong sau khi phá tế bào. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, để DNA bám vào hạt silica. Ly tâm 12000 rpm trong 1phút ở 10°C, thu kết tủa.
- Kết tủa được rửa với 500 µl washing buffer (hoặc ethanol 70%), sau đó ly tâm 12000 rpm trong 1phút. Lặp lại 3 lần để thu DNA sạch.
- Để khô phần kết tủa trong 30 phút ở 30°C. Bổ sung 15µl nước PCR và ủ ở 50°C trong 5 phút (để DNA rời ra khỏi hạt silica). Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút. Thu được dịch DNA và đem giữ lạnh. [74]
2.3.8. PCR fingerprinting
Thành phần phản ứng PCR: 2 µl Taq buffer (10X); 0.4 µl MgCl2 (25 mM); 0.8µl dNTPs (10 mM), 0.8 µl Mồi MST2 (GAC)5 (10 µM); 0.1µl Taq polymerase; 1µl DNA khuôn; 15.9 µl nước cất. Tổng thể tích phản ứng: 21µl. Sau khi trộn đều các thành
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 43 Lê Thị Thùy Linh
phần phản ứng như trên phản ứng được tiến hành trên máy C1000 Touch với chu kỳ nhiệt: 94°C trong 3 phút để làm biến tính hoàn toàn DNA khuôn, tiếp theo là 35 chu kỳ phản ứng lặp lại gồm 3 bước: 94°C trong 40 giây để biến tính DNA, 52°C trong 1 phút để gắn mồi và 72°C trong 2 phút để kéo dài chuỗi, sau đó đến thời gian ủ ở 72°C trong 10 phút và giữ mẫu ở 4°C đến khi phân tích.
Điện di kiểm tra sản phẩm
Bản gel được chuẩn bị bằng agarose hòa tan với dung dịch TAE (Tris- acid acetic- EDTA) 0,5X theo hàm lượng cần thiết, đặt trong lò vi sóng để tan hoàn toàn, để nguội bớt rồi đổ vào khuôn có các lược cài sẵn để tạo bản gel với số giếng nạp mẫu cần thiết. Chờ 20 phút cho gel đông. Đổ TAE lên bề mặt gel chờ 5-10 phút. Khi bản gel đã đông cứng, gỡ lược, đặt bản gel vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE ngập bản gel khoảng 1-2 mm. Lần lượt trộn đều các mẫu cần chạy điện di với loading dye theo tỉ lệ 2:1 tạo thành hỗn hợp có màu xanh và nhỏ vào các giếng trên bản gel. Chạy đồng thời với mẫu DNA chuẩn (marker). Chạy điện di ở 50 V trong 1 giờ.
Nhuộm DNA và đọc kết quả
Kết thúc điện di, gel được lấy ra và nhuộm với Ethyldium bromide (EtBr) 0,5 mg/l pha trong nước cất (trong 20 phút), sau đó vớt gel ra và rửa bằng nước cất để loại bỏ Ethyldium bromide bám không đặc hiệu. Sau khi rửa, các băng DNA được quan sát và chụp ảnh bằng máy soi gel SynGene.
2.3.9. Định tên các chủng nấm mốc dựa vào phƣơng pháp đọc trình tự rDNA
Thành phần phản ứng PCR: 2.5 µl Taq buffer (10X); 0.5 µl MgCl2 (25 mM); 0.5 µl dNTPs (10 mM), 0.5µl Mồi ITS1 (10µM); 0.5µl Mồi ITS4 (10µM); 0.125µl Taq polymerase; 1µl DNA khuôn; 20.375 µl nước cất. Tổng thể tích phản ứng: 26µl. Sau khi trộn đều các thành phần phản ứng như trên, phản ứng được tiến hành trên máy C1000 Touch với chu kỳ nhiệt 95°C trong 5 phút để làm biến tính hoàn toàn DNA khuôn, tiếp theo là 35 chu kỳ phản ứng lặp lại gồm 3 bước: 94°C trong 40 giây để biến
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 44 Lê Thị Thùy Linh
tính DNA, 50°C trong 40 giây để gắn mồi và 68°C trong 2 phút để kéo dài chuỗi, sau đó đến thời gian ủ ở 60°C trong 10 phút và giữ mẫu ở 4°C đến khi phân tích. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1%. Trình tự DNA được đọc bằng phương pháp