Một trong những yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzyme là pH môi trường. Yếu tố pH liên quan đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bền enzyme. Để tìm hiểu ảnh hưởng của pH đến phản ứng thủy phân xylan bởi xylanase I, chúng tôi tiến hành phản ứng enzyme ở các pH khác nhau 2.5; 3.5; 4.0; 4.5; 5.0; 6.0; 7.0. Chúng tôi cũng ủ enzyme ở dải pH như trên để khảo sát độ bền pH của xylanase I. Sau đó thực hiện phản ứng enzyme cơ chất và xác định hoạt tính bằng phương pháp DNS. Kết quả thể hiện ở hình 3.12 a và b. 0 25 50 75 100 0 30 60 90 120 150 180 210 H oạt t ính tƣơng đối ( %) Thời gian (phút)
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 77 Lê Thị Thùy Linh
(a) (b)
Hình 3.12. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính xylanase I. (a): Khảo sát pH tối ưu; (b): Khảo sát độ bền pH của xylanase I.
Xylanase I có phổ pH hoạt động khá rộng từ 3.5 đến 7.0 và hoạt động mạnh nhất ở pH 5.0. Chúng bắt đầu hoạt động yếu từ vùng pH 6.0,enzyme thể hiện được 57% hoạt tính so với hoạt tính ở điều kiện pH hoạt động tối ưu. Ở điều kiện pH trung tính (pH 7.0) hoạt tính xylanase còn 48%. Kết quả về pH tối ưu của xylanase I khá tương đồng với nghiên cứu của Cho và cs [20] trên enzyme D-xylanase I tinh chế từ Penicillium verruculosum, D-xylanase I cũng có pH tối ưu từ 4.0-5.0.
Xylanase I bền khi giữ ở các pH khác nhau và bền nhất ở pH 5.0. Ở pH 2.5 enzyme vẫn giữ được 50% hoạt tính. Từ pH 3.5 đến pH 7.0, có sự tương đồng giữa độ bền pH và khả năng hoạt động ở các pH khác nhau của enzyme. Tuy nhiên, với pH 2.5 thì không có sự tương đồng này, xylanase I chỉ hoạt động 0.7% ở pH 2.5, trong khi đó khi thử độ bền pH ở pH 2.5 enzyme vẫn còn 50% hoạt tính. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 H oạ t tính x yla na se, I u/ l pH 0 20 40 60 80 100 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 H oạ t tính t ƣơng đố i ( %) pH
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 78 Lê Thị Thùy Linh
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Từ 30 mẫu thu thập trên các địa bàn Hà Nội, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Nguyên, Đắc Lắc đã phân lập được 62 chủng nấm mốc có khả năng phát triển ở pH thấp.
2. Bằng kỹ thuật PCR fingerprinting xác lập được 35 nhóm từ 62 chủng nấm mốc đã phân lập và định tên tới loài 33 chủng bằng giải trình tự 18S rDNA.
3. Đánh giá độ bền nhiệt và khả năng hoạt động ở pH thấp của enzyme xylanase từ 62 chủng đã phân lập. Từ đây chọn được chủng Penicillum verruculosum sinh xylanase đáp ứng được mục tiêu đề tài (hoạt tính 17. 84 IU/ml).
4. Xylanase tinh chế từ chủng P. verruculosum có hoạt tính 1.56 IU/ml, bền nhiệt. hoạt động ở dải nhiệt độ rộng từ 10 đến 80°C với thời gian bán hủy (t1/2) là 30 phút ở 75°C. Enzyme này có kích thước khoảng 110 kDa, hoạt động tối ưu ở pH 5 và bền trong khoảng pH 2.5-7.
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 79 Lê Thị Thùy Linh
KIẾN NGHỊ
Mặc dù đã đạt được một số kết quả nhất định trong nghiên cứu, đề tài vẫn còn nhiều thiếu sót do thời gian nghiên cứu còn hạn chế. Để có được những kết quả hoàn thiện và có ý nghĩa thực tiễn, tôi hy vọng có thể tiếp tục nghiên cứu thêm các vấn đề sau:
- Định tên 4 chủng nấm mốc còn lại.
- Tiếp tục tinh chế enzyme xylanase khác của Penicillium verruculosum ở phân đoạn tủa muối 70% và ở các phân đoạn tủa muối còn lại.
- Phân lập và sàng lọc thêm nhiều chủng nấm mốc chịu pH và bền nhiệt khác để có được những chủng tiềm năng có thể ứng dụng trong sản xuất enzyme xylanase nhằm ứng dụng trong chăn nuôi.
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 80 Lê Thị Thùy Linh
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Dương Thanh Liêm, (2008) “Thức ăn và Dinh dưỡng gia cầm”, Nhà xuất bản Nông nghiệp Tp HCM.
2. Dương Thanh Liêm, Bùi Huy Như Phúc và Dương Duy Đồng (2002), “Phương pháp xác định tỷ lệ tiêu hóa”, Thức ăn và dinh dưỡng động vật - Nhà xuất bản nông nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh, tr. 242.
3. Đỗ Hữu Phương (2004), “Thức ăn chăn nuôi”, Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, 1.
4. Phương Phú Công, Mai Thị Hằng (2005), “Nghiên cứu khả năng sinh xylanase của chủng Aspergillus niger GM56 DDB106 đột biến bằng tia UVB trên các chất phế phụ phẩm nông nghiệp để thu enzyme cho chăn nuôi, Tạp chí Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn, 16, tr. 52-54.
5. Quyền Đình Thi (2010), “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi”, Báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ đề tài
6. Trần Thạnh Phong (2004), “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase từ
Trichoderma reesei và Aspergillus niger trên môi trường lên men bán rắn”, Luận văn Thạc sỹ.
7. Vũ Duy Giảng (2009), “Dùng enzyme để tăng hiệu quả sử dụng và giảm giá thành thức ăn chăn nuôi”, Tạp chí khoa học Công Nghệ Chăn nuôi, 16.
Tài liệu tiếng Anh
8. Barry V., Dillon T. (1940), “Occurence of xylans in marinealgae”, Nature 146, 620.
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 81 Lê Thị Thùy Linh
9. Barrera M., Cervantes M., Sauer W. C., Araiza A. B., Torrentera N. (2004), “Ileal amino acid digestibility and performance of growing pig fed wheat-based diets supplemented with xylanase”, Journal of Animal Science, 82 (7), pp. 1997-2003. 10. Bastawde K. B. (1992), “Xylan structure, microbial xylanase, and their mode of
action”, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 8, pp. 353-368.
11. Bedford M., Classen H. (1991), “The influence of dietary xylanase on intestinal viscosity and molecular weight distribution of carbohydrates in rye-fed broiler chick”, Progress in Biotechnology, 7, pp. 361-370.
12. Beg Q. K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G. S. (2001), “Microbial xylanase and their industrial application: a review”, Applied Microbiology Biotechnology Review, 56, pp. 326-338.
13. Belancic A., Scarpa J., Peirano, Diaz A., Steiner R., J. and Eyzaguirre J. (1995) “Penicillium purpurogenumproduces several xylanases: purification and properties of two of the enzyme”, Journal of Biotechnology, 41, pp. 71–79.
14. Bhatt S. S., Chovatiya S. G., Shah A. R. and Katakiya J. V. (2010), “Effects of enzyme supplementation in practical diet for rohu (Labeo rohita) fingerlings”, Journal of Pure and Applied Sciences 18, pp. 9 – 12.
15. Biely P., Markovik O., Mislovicova D. (1985), “Sensitive detection of endo-1,4-β- xylanase in gels”, Analytical Biochemistry, 144, pp. 147-151.
16. Cerrie Silva C. H., Puls J., Valle de Sousa M.V., Filho E.X.F. (1999), “Purification and characterization of low molecular molecular weight xylanase from solid-stae culture of Aspergillus fumigatus Fresenius”, Review Microbiology, 3, pp. 114-119.
17. Chanda S. K., Hirst, E. L., Jones J. K. N. and Percival E. G. V. (1950), “The constitution of xylan from esparto grass”. Journal of the Chemical Society., pp. 12889–12897.
18. Chantasingh D, Pootanakit K, Champreda V, Kanokratana P, Eurwilaichitr L. (2006), “Cloning, expression and characterization of a xylanase 10 from
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 82 Lê Thị Thùy Linh
Aspergillus terreus (BCC129) in Pichia Pastoris”, Protein Expression and Purification, 46, pp. 143-149.
19. Chipeta Z. A., Du-Preez J. C., Szakacs G., Christopher L. (2005), “Xylanase production by fungal strain on spent sulphite liquor”, Applied Microbiology and Biotechnology, 69, pp. 71-78.
20. Cho N. C., Kwon S. J., Kim K., Chung K. C., Chun S. B., (1992), “Purification and characterization of D-xylanase from Penicillium verruculosum, Korean Journal of Biochemistry, 25, pp. 670-675.
21. Christov L. P., Szakacs G., Balakrishnan H. (1999), “Production, partial characterization and use of fungal cellulase-free xylanases in pulp bleaching”,
Process Biochemistry, 34, pp. 511-517.
22. Collins T., Gerday C., Feller G. (2005), “Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases”, FEMS Microbiology Review 29, pp. 3-23.
23. Connerton I., Cummings N., Harris G. W., Debeire P. and Breton C. (1999), “A single domain thermophilic xylanase can bind insoluble xylan: evidence for surface aromatic clusters”, Biochimica et Biophysica Acta, 1433, pp. 110–121. 24. Derewenda U., Swenson L., Green R., Wei Y., Morosoli R., Shareck F., Kluepfel
D. and Derewenda Z. S. (1994), “Crystal structure, at 2.6- Å resolution, of the
Streptomyces lividans xylanase A, a member of the F family of beta-1,4-D- glycanases”, Journal of Biological Chemistry, 269, pp. 20811–20814.
25. Dhillon A., Gupta J. K., Jauhari B. M., Khanna S. (2000), “A cellulase poor, thermostable, alkalitolerant xylanase produced by Bacillus circulans AB 16 grown on rice straw and its application in biobleaching of eucalyptus pulp”, Bioresource Technology, 73(3), pp. 273-277.
26. Eda S., Ohnishi A., Kato K. (1976), “Xylan isolated from the stalk of Nicotiana tabacum”, Agricultural and Biological Chemistry, 40, pp. 359–364.
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 83 Lê Thị Thùy Linh
27. Elegir G., Szakacs M., Jeffries T. W. (1994), “Purification, characterization and substrate specificities of multiple xylanases from Streptomyces sp. strain B-12-2”,
Applied and Environmental Microbiology, 60, pp. 2609–2615.
28. Gruppen H., Hamer R.J, Voragen A.G.J. (1992), “Water – unextractable cell well material from wheat flour, fractionation of alkali – extracted polymers and comparison with waterextractable arabinoxylans”, Journal of Cereal Science, 16, pp. 53-67.
29. Hakulinen N., Turunen O., Janis J., Leisola M. and Rouvinen J. (2003), “Three- dimensional structures of thermophilic beta-1,4-xylanases from Chaetomium thermophilumand and Nonomuraea flexuosa. Comparison of twelve xylanases in relation to their thermal stability”, European Journal of Biochemistry, 270, pp. 1399–1412.
30. Haltrich D., Nidetzky B., Kulbe K. D., Steiner W., Zupancic S. (1996), “Production of fungal xylanases”, Bioresource Technology, 58, pp. 137-161.
31. Harris G. W., Pickersgill R. W., Connerton I., Debeire P., Touzel J. P., Breton C., Perez S. (1997), “Structural basis of the properties of an industrially relevant thermophilic xylanase”, Proteins, 29, pp. 77–86.
32. Kimura T., Ito J., Kawano A., Makino T., Kondo H., Karita S., Sakka K. and Ohmiya K. (2000), “Purification,characterization, and molecular cloning of acidophilic xylanase from Penicillium sp.40”, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 64, pp. 1230–1237.
33. Kormelink F. J. M., Voragen A. G. (1993), “Degradation of different [(glucorono) arabino] xylans by a combination of purified xylan-degrading enzymes”, Applied Microbiology and Biotechnology, 38, pp. 688-695.
34. Krause D. O., Denman S.E., Mackie R.I., Morrison M. Rae A.L., Attwood G.T. and McSweeney C. S. (2003), “Opportunities to improve fiber degradation in the
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 84 Lê Thị Thùy Linh
rumen: microbiology, ecology, and genomics”, FEMS Microbiology Review, 27, 663–693.
35. Kulkarni N., Shendye A. and Rao M. (1999), “Molecular and biotechnological aspects of xylanases”, FEMS Microbiology Review, 23, pp. 411–456.
36. Leggio L., Jenkins J., Harris G. W., Pickersgill R. W. (2000), “X-ray crystallographic study of xylopentose binding to Pseudomonas fluorescens
xylanase A”, Protein: Structure, Function and Genetics, 41, pp. 362-370.
37. Leggio L., Kalogiannis S., Bhat M. K, Pickersgill R. W. (1999), “High resolution structure and sequence of T. aurantiacus xylanase I: implications for the evolution of thermostability in family 10 xylanases and enzymes with (beta)alpha-barrel architecture”, Proteins 36, pp. 295–306.
38. Li K., Azadi P., Collins R., Tolan J., Kim J. and Eriksson K. (2000), "Relationships between activities of xylanases and xylan structures", Enzyme and Microbial Technology, 27, pp. 89–94.
39. Liao H., Xu C., Tan S., Wei Z., Ling N., Yu G., Raaz W., Zhang R., Shen Q., Xu Y. (2012), “Production and characterization of acidophilic xylanolytic enzymes from Penicillium oxalicum GZ-2”, Bioresource Technology, 123, pp. 117-124. 40. Lin J., Larry M., Suren S., Pillay B. (1999), “Purification and biochemical
characteristics of β-D-xylanase from thermophilic fungus Thermomyces lanuginnosus-SSBP”, Biotechnology and Applied Biochemistry, 30, pp. 73-79. 41. Liu L., Wang B., Chen H., Wang S., Wang M., Zhang S., Song A., Shen J., Wu K.,
Jia X. (2009), “Rational pH-engineering of thermostable xylanase based on computational model”, Process Biochemistry, 44, pp. 912-915
42. Liu M. Q., Weng X. Y., Sun J. Y. (2006), “Expression of recombinant Aspergillus niger xylanase A in Pichia pastoris and its action on xylan”, Protein Expression and Purification, 48, pp. 292-299.
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 85 Lê Thị Thùy Linh
43. Luo H., Li J., Wang H., Yang J., Yang Y., Huang H., Fan Y., Yao B., Shi P., Yuan T. (2009), “A thermophilic and acid stable family-10 xylanase from the acidophilic fungus Bispora sp. MEY-1”, Extremophiles, 13, pp. 849-857.
44. Luo H., Wang Y., Li J., Wang H., Yang J., Yang Y., Huang H., Fan Y., Yao B. (2009), “Cloning, expression and characterization of a novel acidic xylanase, XYL11B, from the acidophilic fungus Bispora sp. MEY-1”, Enzyme and Microbial Technology, 45, pp. 126-133 .
45. Maat J., Roza M., Verbakel J., Stam H., DaSilra M., Egmond M. (1992), “Xylanases and their application in bakery”, Progress in Biotechnology, 7, pp. 349- 360.
46. Maheswari M. U., Chandra T. S. (2000), “Production and potential applications of a xylanase from a new strain of Streptomyces cuspidosporus”, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 16, pp. 257-263.
47. Mathrani I. M., Ahring B. K. (1992), “Thermophilic and alkalophilic xylanase from several Dictyoglomus isolates”, Applied Microbiology and Biotechnology, 38, pp. 23-27.
48. Matte A. and Forsberg C. W. (1992), “Purification, characterization, and mode of action of endoxylanases 1 and 2 from Fibrobacter succinogenes S85”, Applied and Environmental Microbiology. 58, pp. 157–168.
49. Michaux C., Pouyez J., Mayard A., Vandurm P., Housen I., Wouters J. (2010), “Structural insights into the acidophilic pH adaption of a novel endo-β-1,4-xylanase from Scytalidium acidophilum”, Biochimie, 92, pp. 1407-1415.
50. Miller G. L. (1959), “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar”, Analytical Chemistry, 31, pp. 426-429
51. Mingan Choct (1999), “Feed Non-Starch Polysaccharides: Chemical Structures and Nutritional Significance”, American soybean association – technical bulletin.
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 86 Lê Thị Thùy Linh
52. Nakamura S., Nakai R., Wakabayashi K. Ishiguro Y., Aono R., Horikochi K. (1993), “Purification and some properties of an alkaline xylanase from alkalophilic
Bacillus sp. Strain 41 M-1”, Applied and Environmental Microbiology, 59, pp. 2311-2316.
53. Nunn J.R., Parolis H. and Russel I. (1973), “Polysaccharides of the red algae
Chaetangium erinaceum. Part I: Isolation and characterization of the water-soluble xylan”, Carbohydrate Research, 26, pp. 169–180.
54. Olukosi O. A., Cowieson A. J., Adeola O. (2007), “Age-related influence of a cocktail of xylanase, amylase and protease or phytase individually or in combination in broilers”, Poultry Science, 86, pp. 77-86.
55. Partride G. and Schulze H. (1997), “Maximising the use of milling by-products in swine feeds”, Presented at Misset Seminar Proceeding.
56. Percival E. G. V. and Chanda S. K. (1950), “The xylan of Rhodymenia palmata”,
Nature 166, 787–788.
57. Prade R. A. (1995) “Xylanases: from biology to biotechnology”, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, 13, pp. 100–131.
58. Puls J., Schmidt O. and Granzow C. (1987), “Glucuronidase in two microbial xylanolytic systems”, Enzyme and Microbial Technology, 9, pp. 83–88.
59. Ratto M., Poutanen K., Viikari L. (1992), “Production of xylanolytic enzyme by an alkalitolerant Bacillus circulans strain”, Applied Microbiology and Biotechnology,
37, pp. 470-473.
60. Rengasayee V., Jerry Thomas N., Siddharth (2005), “B. subtilis optimasation of xylanase enzyme production in Aspergillus spp. In partial fulfillment for the award of the degree of Bachelor of Technology in Chemical Engineering Sri Venkateswara College of Engineering, Pennalur Anna University: Chennai
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 87 Lê Thị Thùy Linh
61. Rifaat H. M., Nagieb Z. A., Ahmed Y. M. (2005), “Production of xylanase by
Streptomyces species and their bleaching effect on rice straw pulp”, Applied Ecology and Environmental Research, 4(1): 151-160.
62. Roberfroid M. B. (1997), “Health benefits of non-digestible oligosaccharides”,
Advances in Experimental Medicine and Biology, 427, pp. 211–219.
63. Roy I., Sharma A., Gupta N.M. (2004), “Three phase partitioning for simultaneous ranaturation and partial purification of A. niger xylanase”, Biochimica et Biophysica Acta, 1698, pp. 107-110.
64. Ruiz M. C., Atonio Di Pietro, M. Isabel G. Roncero. (1997), “Purification and characterization of an acidic endo-β-1,4-xylanase from the tomato vascular pathogen Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici”, FEMS Microbiology Letters, 148, pp. 75-82.
65. Saha B. C., Bothast R.J (1999), “Pretreatment and enzymatic saccharification of corn fiber”, Applied Biochemistry and Biotechnology, 76, pp. 65-77.
66. Sandrim V. C., Rizzatti A. C. S., Terenzi H. F., Jorge J. A., Milagres A. M, Polizeli M. L. T. (2005), “Purification and biochemical characterization of two xylanase produced by Aspergillus caespitosus and their potential kraft pulp bleaching”,
Process Biochemistry, 40, pp. 1823-1828.
67. Shibuya N., Iwasaki T. (1985), “Structural features of rice bran hemicellulose”
Phytochemistry, 24, pp. 285-289.
68. Singh S., Pillay B., Dilsook V., Prior B. A. (2000), “Production and properties of hemicellulose by a Thermomyces lanuginosus strain”, Jouranl of Applied Microbiology, 88, pp. 975-981.
69. Subramaniyan S. and Prema P. (2002), “Biotechnology of microbial xylanases: