Hàng ngàn protein đã được tinh sạch ở dạng có hoạt tính cao dựa trên những đặc tính căn bản như độ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Thông thường, một hỗn hợp protein sẽ trải qua nhiều giai đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên một đặc tính nhất định, để cuối cùng là một protein tinh sạch. Ở mỗi bước phân tách, việc xác định hoạt tính và xác định nồng độ protein đều được thực hiện. Khoảng vài miligram protein tinh sạch có thể giúp ta biết được cấu trúc không gian ba chiều và cơ chế hoạt động của nó. Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: kết tủa bằng muối và dung môi hữu cơ, lọc màng, sắc ký…
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 29 Lê Thị Thùy Linh
Phương pháp kết tủa
Có thể dùng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ để tách chiết các protein. Phương pháp này được tiến hành dựa trện cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước. Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein các dung môi hữu cơ hoặc các muối trung tính.
Phương pháp sắc ký
Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng trong tinh chế protein vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất, khả năng tinh sạch protein cao và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh.
Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách. Trong đó, tùy vào loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha cố định và pha di động.
Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion chromagraphy), sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử (ion exchange chromagraphy), sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác (affinity chromagraphy) và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid chromagraphy).
Phân tách protein bằng điện di trên gel
Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xác định hoạt tính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách là làm hiện hình các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực hiện nhờ kỹ thuật điện di.
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 30 Lê Thị Thùy Linh
Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên gel polyacrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính. Một số chất biến tính protein như: SDS (sodium dodecyl sulfate), LDS (lithium dodecyl sulfate), Formamide. Thường dùng nhất là SDS. Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần giếng. Tính di động của phần lớn các chuỗi polypeptide dưới những điều kiện như thế tỉ lệ với khối lượng của chúng.
Điện di dựa vào điểm đẳng điện
Các protein còn có thể được phân tách bằng điện dựa vào tỉ lệ giữa số acid amin có tính base và số acid amin có tính acid của chúng mà không cần biến tính. Mỗi một protein có một pI riêng. Khi cho hỗn hợp protein chạy trong điện trường trên một miếng gel với một khoảng pH nhất định, không có sự hiện diện của SDS khi đó mỗi protein sẽ di chuyển cho đến khi nó đến vị trí mà tại đó pH bằng pI của nó.
Điện di hai chiều
Do số lượng các phân tử protein trong các mẫu sinh học thường rất lớn nên phương pháp điện di thông thường không đủ để phân tách các protein giống nhau ra khỏi nhau. Vì vậy, các phân tử protein thường được tách trước tiên dựa trên sự khác biệt về điện tích của chúng (gọi là chiều thứ nhất); sau đó, dựa trên sự khác biệt về kích thước (gọi là chiều thứ hai).
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 31 Lê Thị Thùy Linh
CHƢƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU