Sau khi phân lập, các chủng được phân nhóm bằng hình thái khuẩn lạc và tế bào, những chủng nào chắc chắn giống nhau cả về hình thái khuẩn lạc và tế bào được xếp vào một nhóm. Mặc dù việc phân loại bằng hình thái góp phần làm giảm khối lượng công việc ở những bước phân loại tiếp theo nhưng vì sự đa dạng và sai khác không rõ ràng giữa các chủng về mặt hình thái khuẩn lạc cũng như tế bào làm cho việc phân loại dựa vào các đặc điểm này gặp nhiều khó khăn. Để đánh giá tính đa dạng của các chủng phân lập được một cách chính xác, chúng tôi tiến hành phân nhóm 62 chủng phân lập được bằng kỹ thuật fingerprinting, sử dụng mồi MST2 (có trình tự 5’-(GAC)5-3’). Kĩ thuật fingerprinting dựa trên sự tồn tại của các đoạn DNA vệ tinh (DNA satellite) trong genome, đây là các đoạn DNA được lặp lại nhiều lần trong genome.
62 chủng trên được nuôi cấy trên môi trường PDA trong 2 ngày, sau đó tiến hành tách DNA tổng số, sử dụng DNA này làm khuôn cho phản ứng PCR với chu kỳ gia nhiệt như đã nêu ở phần phương pháp. Sản phẩm được điện di trên agarose 1% trong TAE với hiệu điện thế 50 V. Kết quả được trình bày trong hình 3.3.
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 52 Lê Thị Thùy Linh
Hình 3.3. Phổ fingerprinting của các chủng nấm mốc sử dụng mồi MST2. L1-LPH002, L2- LPH005, L3- LPH006, L4-LPH007, L5-LPH010, L6-LPH014, L7-LPH015, L8- LPH018, L9-LPH019, L10-LPH021, L11-LPH022, L12-LPH024, L13-LPH025, L14- LPH026, L15-LPH028, L16-LPH031, L17-LPH032, L18-LPH033, L19-LPH034, L20- LPH035, L21-LPH040, L22-LPH043, L23-LPH044, L24-LPH045, L25- LPH047, L26-LPH049, L27-LPH050, L28-LPH052, L29-LPH055, L30-LPH056, L31-LPH057, L32-LPH058, L33-LPH059, L34-LPH060, L35-LPH061, M-Marker
Kết quả thể hiện ở hình cho ta thấy, sản phẩm PCR nhân với mồi MST2 của các chủng nấm mốc có các phổ băng khác nhau do số lượng cũng như vị trí của DNA vệ tinh trong genome khác nhau. Các chủng cùng một phổ băng sẽ thuộc cùng một loài và sẽ được xếp vào cùng một nhóm. Các chủng có phổ băng khác nhau có thể sẽ thuộc các loài khác nhau tùy theo mức độ khác biệt. Từ 62 chủng ban đầu, chúng tôi phân loại được thành 35 nhóm. Theo nhiều nghiên cứu đã công bố, các chủng có cùng một phổ sản phẩm PCR khi nhân với mồi MST2 sẽ có tên loài giống khi phân loại bằng phương pháp đọc trình tự 18s rDNA. Vì thế, việc phân chia nấm mốc thành các nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting giúp tránh đọc trình tự trùng lặp, giảm chi phí thí nghiệm. Kết quả phân phóm được thể hiện ở bảng 3.2 cùng với tên loài sau khi đọc trình tự.