Từ lâu, xylanase đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau trong thực phẩm như làm mềm rau quả, gạn lọc chất xơ trong công nghiệp nước hoa quả và rượu vang, tách chiết hương liệu, chất màu, dầu thực vật, tinh bột thu nhận đường xylose để chuyển hóa thành xylitol- một chất tạo ngọt có nhiều ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm [12]. Trong công nghiệp sản xuất bánh, xylanase có thể làm tăng độ phồng và giảm độ dính của bánh khi kết hợp với amylase [45]. Xylanase cũng được ứng dụng rộng rãi trong việc hỗ trợ các quá trình xử lý rác thải nông, lâm nghiệp. Ngoài ra, xylanase được sử dụng để hỗ trợ quá trình tẩy trắng trong công nghiệp sản xuất giấy thay vì phải sử dụng các hóa chất độc hại như clo và hypochlorine (ClO2). Đến nay, xylanase từ S. albus và S. chromofuscus đã được ứng dụng thành công trong tẩy trắng bột giấy, sử dụng xylanase từ chủng S. albus giúp độ sáng của bột giấy tăng 4% và xylanase từ S. chromofuscus có hiệu quả tẩy trắng tăng 9.1% so với không xử lý [61]. Một trong những ứng dụng quan trọng được đề cập trong luận văn là ứng dụng của xylanase trong chăn nuôi. Ứng dụng đặc thù trong chăn nuôi yêu cầu enzyme phải đáp ứng các yêu cầu như: bền với nhiệt độ cao (75-80°C) của quá trình ép viên, hoạt
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 19 Lê Thị Thùy Linh
động trong điều kiện pH thấp của dịch dạ dày (pH 2.5-4.0), chịu được tác động của enzyme pepsin của dịch dạ dày động vật.
Nguồn thức ăn cung cấp năng lượng cho gia súc và gia cầm chủ yếu là ngũ cốc và phụ phẩm nông nghiệp. Ngoài protein, lipid, chất dinh dưỡng cung cấp năng lượng chủ yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbonhydrate. Tổng carbonhydrate của thực phẩm bao gồm: polysaccharide không phải tinh bột (non starch polysaccharide: NSP - gồm 2 nhóm tan và không tan), lignin và tinh bột [51]. Nhóm NSP bao gồm cellulose, arabinoxylans, manna, galactan… Arabinoxylan chiếm 60-70% vách tế bào mỏng bao phủ nội nhũ tinh bột và lớp aleurone có trong các loại ngũ cốc.
Bảng 1.2. Hàm lượng NSP và arabinoxylan trong một số loại thức ăn ngũ cốc [2]
Các loại ngũ cốc Arabinoxylan Tổng NSP % Arabinoxylan trong NSP
Lúa mì 8.1 11.4 71 Cám lúa mì 21.9 35.3 62 Lúa mạch 7.9 16.7 47 Kiều mạch 8.9 13.2 67 Bắp 5.2 8.1 64 Cao lương 2.1 4.8 44 Lúa gạo 0.2 0.8 25 Cám gạo 8.5 21.8 39
Nhóm NSP tan làm tăng độ nhớt trong ruột, cản trở tế bào vách ruột hấp thu các chất dinh dưỡng; động vật non đặc biệt là gia cầm rất nhạy cảm với sự biến đổi độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa [2]. Đồng thời, làm tăng lượng nước lưu giữ trong thức ăn, dẫn đến làm giảm lượng thức ăn ăn vào của vật nuôi. Các NSP có khuynh hướng
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 20 Lê Thị Thùy Linh
giữ nước, nó làm ảnh hưởng đến các tác nhân vật lý trong đường ruột như tỷ lệ rỗng bao tử và tỷ lệ các chất đi qua ruột non [55].Mặt khác, NSP không tan có trong vách tế bào thực vật, ngăn trở các enzyme nội sinh tiếp cận với các chất dinh dưỡng như protein, tinh bột và lipid có trong bào chất, làm tăng tiết nước bọt và các enzyme tiêu hóa nội sinh (như trypsin, chymotrypsin, lipase và amylase) có nghĩa là làm hao hụt chất dinh dưỡng của cơ thể từ đó cũng ngăn trở sự tiêu hóa, hấp thu các chất dinh dưỡng này.
Các enzyme do động vật tiết ra từ bộ máy tiêu hóa (enzyme nội sinh) không có khả năng phân giải được các chất thuộc nhóm NSP, chỉ có enzyme của vi khuẩn sống trong ống tiêu hóa hoặc các enzyme ngoại sinh mới có khả năng phân giải được chúng. Chính vì vậy, các enzyme ngoại sinh (là các enzyme sản xuất bằng con đường công nghệ sinh học dưới dạng các chế phẩm) đã được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã được sử dụng trong nhiều thập kỷ qua để cải thiện việc sử dụng thức ăn của gia súc, gia cầm.
Enzyme bổ sung vào thức ăn làm tăng tỷ lệ tiêu hóa thức ăn và năng suất động vật theo hai cơ chế: (1) Kết hợp với enzyme nội sinh phân giải các hợp chất thành những chất có kích thước nhỏ đủ để hấp thu. (2) Enzyme phải giảm được độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa thức ăn. Tuy nhiên, hiệu quả của việc bổ sung enzyme cũng tùy thuộc vào loại thức ăn trong khẩu phần. Khẩu phần lúa mì nếu được bổ sung enzyme xylanase (hay pentosanase) thì hiệu quả hơn bổ sung enzyme này vào khẩu phần lúa mạch, vì lúa mì có nhiều arabinoxylan hơn lúa mạch. Ngược lại, khẩu phần lúa mạch nếu được bổ sung β-glucanase thì hiệu quả hơn bổ sung enzyme này vào khẩu phàn lúa mì, vì lúa mạch nhiều glucan hơn lúa mì. Chính vì vậy, để tăng cường hai cơ chế trên, enzyme bổ sung vào thức ăn thường được sản xuất dưới dạng những chế phẩm đa enzyme (multi-enzyme) để phân giải đồng thời nhiều hợp chất. Mặt khác, khi bổ sung
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 21 Lê Thị Thùy Linh
enzyme cần phải lựa chọn enzyme sao cho phù hợp với thành phần nguyên liệu trong khẩu phần ăn..
Việc sử dụng enzyme xylanase bổ sung vào thức ăn cho chăn nuôi có tác dụng phân giải xylan- một thành phần trong nhóm NSP, có nhiều trong thức ăn của vật nuôi- giúp các enzyme nội sinh có cơ hội tiếp xúc và phân giải các chất dinh dưỡng như tinh bột, protein, chất béo. Xylanase cũng có tác dụng phân cắt xylan giải phóng đường xylose và các phân đoạn XOS (xylooligosaccharide), giảm độ nhớt của dịch ruột, tăng khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng. XOS còn có tác dụng như một prebiotic, nó tranh giành vị trí bám dính của vi khuẩn gây bệnh trên vách ruột và loại bỏ những vi khuẩn gây bệnh ra khỏi ruột, nó cũng kích hoạt hệ miễn dịch của ruột, làm cho ruột khỏe. [75], [62]. Như vậy, sử dụng xylanase một cách độc lập hay kết hợp với các enzyme khác có tác dụng tăng hiệu quả sử dụng năng lượng thức ăn, ngăn ngừa rối loạn tiêu hóa, tăng được độ đều bầy, tăng năng suất sản phẩm chăn nuôi, hạn chế phân ướt và ô nhiễm môi trường, từ đó giảm được chi phí chăn nuôi.
Hiện này, hầu hết các công ty sản xuất enzyme đều đã đưa xylanase vào trong danh mục sản phẩm của mình, tuy nhiên các công ty lớn như Danisco Animal Nutrition, Novozymes/DSM, BASF và Adissco… thường cung cấp xylanase dưới dạng chế phẩm thương mại hoàn thiện (có thể bao gồm hỗn hợp nhiều enzyme, trong đó có chứa xylanase). Do đó, thị trường xylanase nguyên liệu lại chủ yếu do các công ty Trung Quốc và Ấn Độ kiểm soát. Một số công ty sản xuất và cung cấp enzyme xylanase nguyên liệu cho ngành công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi trên thế giới, tiêu biểu như:
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 22 Lê Thị Thùy Linh
Bảng 1.3. Một số công ty sản xuất và cung cấp enzyme xylanase nguyên liệu
Quốc gia Các công ty sản xuất xylanase lớn
Trung Quốc
Beijing Challenge Bio-Technology Limited Company Wuxi Green year Union Works Co., Ltd
Sukahan (Weifang) Bio-Technology Co., Ltd En Bio-Tech Limited Company
Ấn Độ
Noor Enzymes
Shri GBS Biotech Pvt. Ltd Aumgene Biosciences Ovt. Ltd Kaypeeyes Biotech Private Limited
Đức AB Enzymes
Canada Ultra Bio-Logics Inc Anh Danisco Animal Nutrition
Mỹ Verenium
ChenGen
Tại Việt Nam hiện nay chưa có đơn vị nào sản xuất xylanase nguyên liệu dành cho mục đích thương mại. Hầu hết các công ty phân phối xylanase hiện nay đều nhập khẩu nguồn nguyên liệu này từ các công ty sản xuất lớn tại Trung Quốc, Mỹ, Ấn Độ và Canada… Một số công ty nhập khẩu và phân phối nguyên nguyên liệu xylanase cho ngành công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam có thể kể đến như:
Bảng 1.4. Một số công ty nhập khẩu và phân phối nguyên nguyên liệu xylanase cho ngành công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam
TT Công ty Thông tin chi tiết
1
Cty TNHH CNSH Dƣợc Nanogen
Lô 1-5C, Khu CNC, Nhơn Phú, Q9, TP.HCM Tel: 08.3 730 9931 – 08.3 730 9945
Website: hppt://nanogenpharma.vn
- Đặc tính enzyme: dạng bột mịn - Hoạt độ: 1.000 IU/g
- Nguồn nhập: Trung Quốc - Giá: 100 000 VNĐ/1kg 2
Công ty TNHH Rừng biển
10/1, đường số 3, p.Tân Kiểng, Q.7, TP.HCM Tel: 08.3 771 7705
- Đặc tính enzyme: Dạng bột - Hoạt độ: 15.000 U/g
- Nguồn nhập: hãng BCM, Mỹ - Giá: 5-6 USD/1kg
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 23 Lê Thị Thùy Linh
Một số chế phẩm phục vụ chăn nuôi chứa xylanase đang được sử dụng tại Việt Nam:
Bảng 1.5. Một số chế phẩm phục vụ chăn nuôi chứa xylanase sử dụng tại Việt Nam
TT Tên thức ăn chăn nuôi Bản chất, công dụng Hãng, nƣớc sản xuất
Hãng Nƣớc
1 HOSTAZYM X 15000
Liquid Bổ sung enzyme xylanase trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm
BIOVET Joint Stock Company, Bulgaria Bulgaria 2 HOSTAZYM X 15000 MicroGranulate
3 Sunzyme Bổ sung hỗn hợn enzyme Xylanase, Mannanase trong thức ăn chăn nuôi
Wuhan Sunhy Biology Co. Ltd
Trung Quốc 4 Ronozyme® WX (CT) Cung cấp men tiêu hóa Xylanase cho
gia súc Novo Zyme A/S Đan Mạch
5 Ronozyme® WX (L) 6 Optimise HS
Bổ sung hỗn hợp Enzyme tiêu hóa (Beta glucanase, Xylanase và Phytase) cho gia súc, gia cầm
Optivite International Anh 7 Optimise MB 8 Optizyme 9 Optizyme HS 10 Danico Xylanase 40000L
Bổ sung enzyme Xylanase trong thức ăn chăn nuôi lợn và gia cầm
Genencor
International Oy Phần Lan 11 Econase XT 25 Bổ sung enzyme Xylanase trong
thức ăn chăn nuôi
AB Enzymes
GmbH Phần Lan
12 Econase XT 25L
Bổ sung enzyme Xylanase trong
thức ăn chăn nuôi ROAL Oy Phần Lan
13 Econase XT 5P 14 Econase XT P 15 Enerzyme
Bổ sung hỗn hợp enzyme (Xylanase, Manase, Beta-glucanase) trong thức ăn cho gia súc và gia cầm
Crown Pacific Biotechnology
Pte. Ltd.
Singapore
16 Ronozyme® G2 G Cung cấp enzyme Xylanase Glucanase trong thức ăn chăn nuôi
DSM Nutritional Products Ltd. Site Sissein Thụy Sỹ 17 Hemicell® -W Từ Bacillus lentus và nấm Trichoderma longibrachiatum nhằm
bổ sung enzyme β-mannanase và β- xylanase vào thức ăn chăn nuôi
ChemGen Corporation Mỹ 18 Hermicell® -W 19 Wheatease 20 WheatEase M 21 Wheatease-M MP
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 24 Lê Thị Thùy Linh
1.2.6. Tình hình nghiên cứu xylanase trong nƣớc và trên thế giới
Tình hình nghiên cứu trên thế giới.
Nghiên cứu trên thế giới về các enzyme sử dụng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã tiến được những bước dài và đến nay những nghiên cứu về các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi vẫn được tiếp tục theo các hướng khác nhau.
Trên thế giới, những nghiên cứu theo hướng cải thiện chất lượng và hiệu quả của các enzyme hiện có trên thị trường đã có từ rất sớm, ngay từ những năm 1991, Bedford và cs đã bổ sung xylanase từ Trichoderma longibrachiatumi vào khẩu phần ăn lúa mạch đen của gà thịt làm giảm độ nhớt trong ruột, giúp tăng khối lượng và nâng cao hiệu quả chuyển hoá thức ăn của gà [11]. Trong một nghiên cứu của Barrera và cs về khả năng tiêu hóa amino acid và chăn nuôi lợn bằng thức ăn bổ sung xylanase đã rút ra kết luận sự bổ sung xylanase vào thức ăn chăn nuôi trong đó lúa mì là nguồn cung cấp protein và năng lượng duy nhất đã cải thiện được các chỉ số AID (apparent ileal digestibility - khả năng tiêu hóa rõ ràng ở ruột hồi ) của amino acid, ADG và tỷ lệ thức ăn: tăng trọng; tuy nhiên sự cải thiện này ít hơn khi bổ sung amino acid tổng hợp [9]. Rengasayee và cs [60] đã tối ưu các thông số vận hành để sản xuất xylanase sử dụng chủng tự nhiên Aspergillus bằng lên mên mẻ chìm sử dụng thiết bị bán tự động. Đây là thí nghiệm đầu tiên sử dụng chủng nấm sợi để sản xuất enzyme ở công ty Spic Biotech Ltd (nhà sản xuất chính các enzyme công nghiệp ở Ấn Độ), mà cho tới nay chỉ được sử dụng nuôi cấy vi khuẩn. Sau khi thực hiện lên men một số mẻ 200 lít để thu được các thông số về tốc độ, khuấy, sục khí, pH, độ nhớt, thể tích, hoạt tính enzyme, nhiệt độ, họ đã nâng quy mô lên lên 1500 lít rồi 9000 lít để sản xuất xylanase. Gần đây, Olukosi và cs (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng liên quan tới thời gian chăn nuôi của dịch chiết xylanase, amylase và protease hoặc phytase đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau trong chăn nuôi gà giò. Nghiên cứu này chỉ ra rằng sự kết hợp XAP (xylanase, amylase, protease) và phytase đều có hiệu quả trong việc cải thiện tiêu hóa phosphorus và giúp gà giò hấp
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 25 Lê Thị Thùy Linh
thu dinh dưỡng bột ngô – đậu nành [54]. Năm 2010, Bhatt và cs [14] đã tiến hành thí nghiệm trêm cá rohu giống (Labeo rohita) với thức ăn được trộn thêm enzyme xylanase sản xuất từ Aspergillus foetidus (MTCC 4898) với hoạt lực 184 U/g. Cá được cho ăn trong 30 ngày và cân 1 lần/tuần. Kết quả thí nghiệm cho thấy nghiệm thức thức ăn có bổ sung xylanase cho tăng trọng và hệ số tăng trưởng đặc biệt cao hơn so với đối chứng.
Bên cạnh hướng cải thiện chất lượng và hiệu quả của các enzyme, tạo ra các enzyme tái tổ hợp với năng suất cao chất lượng mới cũng được các nhà khoa học trên thế giới hết sức quan tâm. Năm 2006, Liu và cs đã biểu hiện thành công peptide trưởng thành của xylanase A chủng Aspergillus niger (AnxA) trong Pichia pastoris với năng suất cao dưới sự kiểm soát của AOX1 promoter. Những nghiên cứu về tính chất của enzyme AnxA tái tổ hợp (reAnxA) cho thấy rằng nhiệt độ tối ưu và pH tối ưu của enzyme lần lượt là 50°C và 5.0. reAnxA bền vững ở dãy pH rộng 3.0-8.0. Sau khi ủ ở pH 3.0-8.0, 25°C trong một giờ, tất cả hoạt tính còn lại của reAnxA đều trên 80% [42]. Chantasingh và cs (2006) đã nhân dòng và đọc trình tự gene xylanase đầy đủ, mã hóa 326 amino acid thuộc họ GH10 từ Aspergillus terreus BCC129. Xylanase tái tổ hợp được biểu hiên trong Pichia pastoris và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel đã chứng tỏ hoạt tính tối ưu ở 60°C, pH 5.0 và Km 4.8 ± 0.07 mg/ml và Vmax 757 ± 14,5 µmol/phút mg, sử dụng birchwood xylan làm cơ chất. Ngoài ra, enzyme tinh sạch chứng tỏ độ bền pH từ 4-10 khi ủ ở 40°C trong 4 giờ [18].
Không chỉ dừng ở mức độ tạo ra các enzyme tái tổ hợp, các nhóm nghiên cứu trên thế giới còn đi xa hơn một bước nữa là cải biến các enzyme đang có hoặc chuyển gen mã hóa enzyme vào thực vật bằng công nghệ DNA tái tổ hợp và công nghệ protein. Yang HM và cs (2006) đã tạo xylanase TB lai được thiết kế bằng cách thay thế phân đoạn đầu N của Streptomyces olivaceoviridis xylanase XYNB với vùng tương ứng của
Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật 26 Lê Thị Thùy Linh
Escherichia coli BL21 và Pichia pastoris GS115. TB được tinh sạch và các tính chất enzyme được xác định. Các kết quả khám phá ra nhiệt độ và pH tối ưu của TB là 70°C và 6.0, kết quả này được cải thiện hơn so với XYNB. Độ bền nhiệt của TB gấp 6 lần XYNB [78]. Năm 2007, Yang P và cs đã biểu hiện xylanase với hoạt tính đặc hiệu cao từ chủng Streptomyces olivaceoviridis A1 trong cây khoai tây chuyển gen (Solanum tuberosum L.). Protein tái tổ hợp XYNB đạt tới 5% protein lá hòa tan tổng số trong tế bào chất. Trong dịch chiết thân và lá, hoạt tính xylanase đạt tới 87 µmol min-1 g-1 lá tươi (9.7 µmol min-1
g-1 protein tổng số). Xylanase bền ở 60°C và 70°C trong đệm (pH 5.2) tới 5 phút [79]. Hơn nữa, hoạt tính enzyme xylanase giữ nguyên không thay đổi qua nhiều thế hệ khoai tây. Những kết quả này chứng mình rằng khoai tây chuyển gene có thể được sử dụng để sản xuất ra xylanase với hoạt tính enzyme đặc hiệu cao và có thể là một giải pháp khác đối với cách bổ sung xylanase ngày nay vào thức ăn chăn nuôi.
Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Việc sử dụng xylanase trong thức ăn chăn nuôi đã được quan tâm tại Việt Nam từ