Cĩ khá nhiều phương pháp làm giàu PUFAs, chẳng hạn như phương pháp phân đoạn bằng chất lỏng siêu tới hạn, phân đoạn bằng sắc ký, phương pháp enzyme,… nhưng phương pháp tạo tủa urea vẫn là lựa chọn phù hợp nhất đối với thí nghiệm này vì nĩ là một phương pháp đơn giản, khơng địi hỏi nhiều thiết bị phức tạp và chi phí thực hiện tương đối thấp, phù hợp với điều kiện và quy mơ phịng thí nghiệm. Chính vì vậy, phương pháp tủa urea được áp dụng rất rộng rãi trong các cơng trình nghiên cứu khoa học.
Phương pháp tủa urea được nhiều nhà nghiên cứu ưa thích vì sự tạo phức phụ thuộc vào cấu hình của các nguyên tố FAs do sự hiện diện của nhiều liên kết đơi (Salimon et al., 2012). Đây là phương pháp tách các acid béo bão hịa (SFAs) và acid béo bất bão hịa một nối đơi (MUFAs) ra khỏi PUFAs dựa trên nguyên tắc SFAss và MUFAs thì tạo phức kết tủa urea (Zhang et al, 2006). Ngồi ra, SFAs và MUFAs dễ dàng tạo kết tủa với urea và kết tinh khi làm lạnh trong quá trình tạo phức urea. Sự hình thành phức tủa urea được mơ tả như hình 4.4.
46
Hình 4.4: Sự hình thành các tinh thể urea khi khơng cĩ và cĩ acid béo chuỗi dài
(Nguồn: Shahidi and Wanasundara,, 1998)
Các phức chất này sau đĩ cĩ thể được loại bỏ bằng cách lọc (hình 4.5). Phần chất lỏng hoặc khơng tủa urea là PUFAs đã được làm giàu bằng cách loại bỏ các tinh thể được hình thành bao gồm SFAs và MUFAs (Salimon et al., 2012). Ngồi ra từ hình 4.5 cịn thấy được tủa urea của các acid béo tự do trích từ các nguyên liệu khác nhau sẽ cĩ hình dạng tinh thể khác nhau.
a. Mỡ cá tra b. Đầu cá hồi c. Hạt Chia
Hình 4.5: Tủa urea sau 24 giờ làm lạnh từ phản ứng tủa urea của acid béo tự do trích từ các nguyên liệu khác nhau
Khối lượng acid béo được sử dụng cho thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh đến hiệu suất thu hồi là 1 g cho mỗi nghiệm thức. Qua tham khảo tài liệu Wanasundara và Shahidi, 1999; Zhang et al., 2006 cùng các thí nghiệm thăm dị và điều kiện phịng thí nghiệm nên khảo sát được tiến hành với ở các nhiệt độ là nhiệt độ phịng, 2oC và -15oC với tỉ lệ cố định acid béo tự do và urea là 1:4 (w:w) và tỉ lệ urea/ethanol 95o là 1:10 (w:v). Hiệu suất thu hồi PUFAs được tính theo cơng thức 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ kết tinh urea đến hiệu suất thu hồi PUFAs được thể hiện qua bảng 4.7.
47
Bảng 4.7: Hiệu suất thu hồi thành phẩm ứng với các nhiệt độ kết tinh khác nhau
Nhiệt độ (oC)
Hiệu suất thu hồi (%)
Mỡ cá tra Đầu cá hồi Hạt Chia
Nhiệt độ phịng 38,60b 36,27a 45,50a 2 48,02c 43,14c 59,00c -15 35,42a 38,24b 50,50b F = 84,820 P = 0,0000 F = 254,08 P = 0,0000 F = 358,20 P = 0,0000
Ghi chú: các chữ cái khác nhau trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5%
Dựa vào kết quả bảng 4.7, cho thấy cĩ sự khác biệt ý nghĩa giữa các hiệu suất thu hồi PUFAs tại các nhiệt độ khảo sát khác nhau. Điều này chứng tỏ nhiệt độ kết tinh cĩ ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi PUFAs. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi PUFAs ở nhiệt độ phịng, 2oC, -15oC trong thời gian 24 giờ cho thấy hiệu suất thu hồi đạt cao nhất khi tiến hành kết tinh ở 2oC là 48,02% (mỡ cá tra), 43,14% (đầu cá hồi) và 59,00% (hạt Chia) so với hai nhiệt độ cịn lại.
Ở nhiệt độ thấp, các acid béo cĩ xu hướng hình thành các hợp chất urea nhiều hơn ở nhiệt độ cao (Raviya et al., 2016). Nhiệt độ kết tinh thấp hơn cĩ thể tạo điều kiện hình thành kết tinh urea ổn định hơn, điều này sẽ làm giảm SFAs trong NUCF (phần phức chất lỏng khơng bị kết tủa urea). Nhiệt độ càng cao, xu hướng của các acid béo tạo kết tủa với các hợp chất urea càng thấp, và do đĩ hiệu suất thu PUFAs thấp hơn (Salimon et al., 2012). Tuy nhiên ở nhiệt độ -15oC lại cho hiệu suất thấp hơn 2oC, nguyên nhân là do khi nhiệt độ quá thấp, thì EPA cĩ thể bị kết tủa, điều này đã được ghi nhận trong nghiên cứu của Raviyan et al., 2016, nhĩm tác giả đã chỉ ra rằng DHA là một phần chính trong phân đoạn phức hợp khơng urea, trong khi EPA là một phần chính trong phân đoạn phức urea, EPA cĩ xu hướng lớn hơn DHA trong việc tạo thành kết tinh với hợp chất urea, điều này được xác nhận bởi các nghiên cứu trước đây về dầu cá biển (Ratnayake et al., 1988; Wanasundara and Shahidi, 1999). Theo Robles-medina et al., 1998, khi EPA là acid béo mong muốn, thì sự kết tinh urea ở nhiệt độ cao hơn (20 – 28°C) được ưu tiên hơn vì ở nhiệt độ này sẽ thu được nhiều EPA hơn. Nhiệt độ quá thấp sẽ làm cho acid béo đơng đặc lại, cản trở quá trình chiết tách PUFAs, dẫn đến hiệu suất thấp.
Trong nghiên cứu của nhĩm tác giả Đặng Diễm Hồng et al., 2014 cũng đã nêu sự ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh trong quá trình kết tinh và làm giàu hỗn hợp acid béo Omega-3 từ vi tảo biển, kết quả cho thấy ở nhiệt độ 40C hiệu suất tách PUFAs cao nhất so với nhiệt độ ở 150C và 250C. Kết quả thí nghiệm tương tự với nghiên cứu của Setyawardhani et al., 2015, nhĩm tác giả đã khảo sát nhiệt độ thích hợp cho quá trình tủa urea làm giàu các acid béo bão hịa đa nối đơi từ dầu thực vật ở các điều kiện nhiệt độ từ -15°C đến 30°C và nhận thấy rằng hiệu suất thu hồi hỗn hợp các acid béo này đạt cao nhất khi tiến hành kết tinh ở 5°C. Ngồi khảo sát ở nguồn nguyên liệu thực vật thì
48
nghiên cứu của nhĩm tác giả Medina et al., 1995 đã khảo sát nhiệt độ kết tinh từ -360C
đến 360C của dầu cá tuyết và nhận thấy rằng 40C là nhiệt độ tối ưu cho quá trình thu nhận EPA và DHA so với các nhiệt độ khác (Medina et al., 1995). Tương tự nghiên cứu của nhĩm tác giả Zhang et al., 2006 đã khảo sát nhiệt độ kết tinh (-25 0C đến 25 0C) và cũng nhận thấy rằng nhiệt độ kết tinh là -50C và thời gian kết tinh là 20 giờ là tối ưu cho quá trình thu nhận DHA và EPA từ dầu cá ngừ (Zhang et al., 2006).
Tĩm lại, nhiệt độ kết tinh tạo phức urea ở 2oC cho hiệu suất thu hồi PUFAs cao nhất.
4.5SO SÁNH KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SẢN PHẨM OMEGA-3 TỪ MỠ CÁ TRA,
ĐẦU CÁ HỒI VÀ HẠT CHIA
4.5.1 Hàm lượng Omega-3
Mẫu thành phẩm sẽ được phân tích thành phần Omega-3 bằng phương pháp CASE.SK.0107-GC tại trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm thành phố Hồ Chí Minh- chi nhánh Cần Thơ. Thành phần Omega-3 thu được từ hạt Chia được thể hiện ở bảng 4.8.
Bảng 4.8: Thành phần Omega-3 từ ba nguồn nguyên liệu khác nhau
STT Tên acid béo Đơn vị Mỡ cá tra
Đầu cá hồi
Hạt Chia
1 α-Acid Linolenic (ALA: C18:3n3) g/100 g 1,24 8,00 73,80
2 Acid Eicosapentaenoic (EPA:
C20:5n5) g/100 g 0,11 3,66 -
3 Acid Docosahexaenoic (DHA:
C22:6n3) g/100 g 0,29 4,37 -
Omega-3 g/100 g 1,64 16,03 73,80
Ghi chú: “-” khơng cĩ giá trị
Kết quả bảng 4.8 cho thấy nguồn nguyên liệu mỡ cá tra cĩ hàm lượng Omega-3 thấp nhất (1,64 g/100 g). Bởi vì bản chất trong nguyên liệu này thành phần Omega-3 chiếm khơng cao (Lê Thị Thanh Xuân et al., 2018). Kết quả này tương tự với nghiên cứu của hai tác giả Nguyễn Văn Nguyện và Nguyễn Ngọc Trâm Anh (2013) khi tiến hành phân tích và đánh giá đặc điểm lipid của cá tra ở các giai đoạn với các kích cỡ khác nhau, kết quả cho thấy hàm lượng Omega-3 tương đối thấp, hàm lượng Omega-3 ở cá tra cĩ kích cỡ 4 – 10 g là 0,224 g/100 g mẫu ướt, 0,233 g/100 g mẫu ướt đối với cá tra từ 30 – 40 g và 0,085 g/100 g mẫu ướt đối với cá tra từ 100 – 200 g. Vì vậy, với lượng mỡ cá tra thu mua từ khu cơng nghiệp thì đề tài khơng thể kiểm sốt được mỡ cá là thuộc giống cá cĩ kích cỡ nào. Mặt khác, tác giả cịn giải thích lượng acid béo giảm là do nguồn thức ăn, điều kiện sinh sống của cá tra. Kết quả này cịn tương tự như nghiên cứu của tác giả Lê Thị Thanh Xuân et al., 2018, tác giả đã sử dụng dung mơi n-hexane để
49
chiết tách Omega-3 từ mỡ cá tra với 2 lần chiết, kết quả thu nhận hàm lượng các acid béo ALA, EPA và DHA tương ứng là 0,318%, 0,168% và 0,292%, tổng Omega-3 là 0,778%. Cũng cùng tác giả và thời gian nghiên cứu nhưng đối tượng nghiên cứu là cá basa, kết quả thu được Omega-3 được trích từ hệ dung mơi DES (Deep Eutectic Solvent) là 0,46% ALA, 015% EPA và 0,63% DHA.
Cịn đối với đầu cá hồi cũng cho hàm lượng Omega-3 là 16,03 g/100 g cao hơn Omega-3 từ mỡ cá tra nhưng hiện nay nguồn nguyên liệu này đã được dùng khá phổ biến trong các mĩn ăn và cũng cung cấp cho cơ thể giá trị dinh dưỡng tốt thơng qua các mĩn ăn. Hàm lượng Omega-3 trong đầu cá hồi tương đối thấp hơn so với các nguyên liệu khác bởi vì theo Dave et al., 2014 thì đầu cá chỉ chiếm khoảng 10,57% trong tổng khối lượng của tồn con cá và lượng mỡ trích được ở nhiệt độ ở 90oC, thời gian 20 phút chỉ chiếm khoảng 48,03%. Kết quả thu được gồm 1,76 g/100 g ALA, 8,68 g/100 g EPA và 8,45 g/100 g DHA.
Với nguyên liệu hạt Chia đã cho ra hàm lượng Omega-3 cao nhất (73,80 g/100 g) nhưng thành phần Omega-3 chỉ cĩ α - linolenic acid (ALA). Theo như Gao, F. et al. thì khả năng tạo ra các acid béo Omega-3 chuỗi dài từ ALA cĩ thể suy yếu trong quá trình lão hĩa (Gao et al., 2013). Tuy nhiên sự tổng hợp này rất ít, khơng đủ đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cơ thể, do đĩ cần cung cấp trực tiếp DHA và EPA (Tsamouris et al., 2002). Kết quả này cao hơn kết quả nghiên cứu của các tác giả de Mello et al., 2015 với tổng lượng dầu Chia tổng hợp được chiết xuất bằng sĩng siêu âm khoảng 82%, trong đĩ linoleic acid (20,4 g 100/g) và linolenic acid (66,3 g 100/g). Nguyên nhân sự khác biệt về phần trăm α - linolenic acid (ALA) ở các nghiên cứu cĩ thể do nguồn nguyên liệu ở từng khu vực địa lý khác nhau và các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu cũng khác nhau.
Bảng 4.8 cĩ thể thấy Omega-3 của nguồn nguyên liệu đầu cá hồi và mỡ cá tra hiện diện cĩ ba loại acid béo chủ yếu. Trong đĩ ALA cĩ hàm lượng cao nhất so với hai acid cịn lại là EPA và DHA. Đây cũng là thành phần cĩ chuổi acid béo ngắn cĩ thể tổng hợp nên EPA và DHA, hai loại acid béo chuỗi dài quan trọng tạo nên giá trị của Omega-3. Bên cạnh đĩ, kết quả trên cịn cho ra EPA và DHA cĩ hàm lượng lần lượt là tuy khơng cao nhưng phù hợp với nghiên cứu của Raviyan et al. (2016) cũng cho ra hàm lượng EPA (31,06%) thấp hơn DHA (56,25%). Nguyên nhân dẫn đến hàm lượng của EPA thấp hơn DHA cĩ thể là EPA thấp hơn DHA trong cá ở Châu Á (Raviyan et al., 2016). Bên cạnh đĩ, EPA cĩ xu hướng tạo phức với urea hơn là DHA điều này được xác nhận bởi nghiên cứu của Ratnayake et al., 1988; Wanasundara và Shahidi, 1999.
Ngồi ra, từ kết quả thu được lượng ALA khá cao cĩ thể đánh giá được khả năng ứng dụng của phương pháp siêu âm trong trích ly Omega-3 từ ba nguyên liệu khác nhau bởi tính hiệu quả của phương pháp này mang lại như rút ngắn thời gian quá trình trung hịa mà khơng làm thay đổi tính chất của các thành phần acid béo trong Omega-3 của các nguyên liệu như mỡ cá tra (hình 4.6) khi so sánh với hình ảnh quang phổ GC của
50
mỡ cá tra sử dụng dung mơi methanol để ly trích Omega-3, 6, 9 trong nghiên cứu của Lê Thị Thanh Xuân et al., 2018 (hình 4.7), đầu cá hồi (hình 4.8) khi so sánh với hình ảnh quang phổ GC của đầu cá hồi tinh sạch và làm giàu dầu cá hồi thương mại bằng phương pháp tủa urea trong nghiên cứu Pando et al., 2014 (hình 4.9) và hạt Chia (hình 4.10) khi so sánh với hình ảnh quang phổ GC của dầu hạt Chia được chiết xuất bằng dung mơi n-hexan trong nghiên cứu của Hrnčič et al., 2018 (hình 4.11).
51
Hình 4.7: Phổ GC/FID của Omega-3, 6, 9 trong mỡ cá tra
(Nguồn: Lê Thị Thanh Xuân et al, 2018)
52
Hình 4.9: Biểu đồ sắc ký este methyl acid béo tương ứng với dầu cá cá hồi
(Đỉnh sắc ký. 1: C12:0; 2: C14:0; 3: C16:0; 4: C16:1 9t; 5: C16:1 9c; 6: C16:1 11c; 7: C17:0; 8: C16:1 13c; 9: C17:1c; 10: C18:0; 11: C18:1 9c; 12: C8:1 11c; 13: C 18:2 9c,12t; 14: C18:29t,12c; 15: C18:2 9c,12c; 16: C18:2 9c,15c; 17: C20:0; 18: C18:3 n-6 (γ-linolenic); 19: C20:1 8c; 20: C20:1 11c; 21: C18:3 n-3 (α-linolenic); 22: C18:4 n-3; 23: C 20:2 n-6; 24: C 22:0; 25: C 20:3 n-6; 26: C22:1; 27: C20:3 n-3; 28: C20:4 n-3; 29: C22:2 n-6; 30: C20:5 n-3; 31: C24:1; 32: C22:4 n-6; 33: C22:5 n-3; 34: C22:6 n-3)
(Nguồn: Pando et al., 2014)
53
Hình 4.11: Hình ảnh quang phổ sắc ký khí - phân tích khối phổ của các acid béo cĩ trong hạt Chia được trích ly bằng dung mơi hexan (1 - palmitic, 2 - stearic, 3 - oleic, 4 - linoleic, 5 -
linolenic)
(Nguồn: Hrnčič et al., 2018)
Khơng những thế, phương pháp siêu âm cịn sử dụng hữu hiệu đối với nguyên liệu thực vật khác như hạt lanh ở nghiên cứu của nhĩm tác giả Li et al., 2008 khi trích ly dầu hạt lanh bằng phương pháp siêu âm chiếm 56% α - linolenic acid. Tác giả cũng khẳng định việc xử lý bằng sĩng siêu âm tăng đáng kể khả năng thu hồi α-Linolenic acid (ω- 3) từ dầu hạt lanh (Li et al., 2008). Tương tự cĩ nghiên cứu của nhĩm tác giả Gutte et al., 2015, đã khảo sát ảnh hưởng của việc tối ưu hĩa quá trình chiết tách dầu hạt lanh bằng cách trích ly hỗ trợ siêu âm và xác định ảnh hưởng của nĩ đối với Omega-3, kết quả cho thấy, việc trích ly cĩ hỗ trợ bằng sĩng siêu âm tăng đáng kể khả năng thu hồi ALA, trong khi các PUFA khác khơng cho thấy sự thay đổi đáng kể.
4.5.2 Chỉ tiêu cảm quan và chỉ số đặc trưng của sản phẩm Omega-3
Thành phẩm thu được ngồi phân tích hàm lượng Omega-3 cịn phân tích các chỉ số đặc trưng để đánh giá chất lượng thành phẩm. Kết quả phân tích các chỉ số đặc trưng được thể hiện ở bảng 4.9.
Bảng 4.9: Kết quả phân tích chỉ số đặc trưng của thành phẩm Omega-3 từ ba nguồn nguyên liệu khác nhau
STT Chỉ tiêu Đơn vị Mỡ cá tra Đầu cá hồi Hạt Chia
1 Cảm quan - Vàng nhạt, trong Vàng cam, trong Vàng đậm, trong 2 Chỉ số acid mg KOH/g 18,53 0,62 24,11
54
STT Chỉ tiêu Đơn vị Mỡ cá tra Đầu cá hồi Hạt Chia
3 Chỉ số peroxide
meq O2/kg
0,09 0,08 0,01
4 Chỉ số iod g I2/ 100 g 129,21 136,66 185,46
Ghi chú: “-” khơng cĩ giá trị
a. b. c.
Hình 4.12:Kết quả cảm quan màu sắc của các sản phẩm là mỡ lỏng sạch và dầu thơ, hỗn hợp acid béo tự do, thành phẩm (từ trái sang phải) của a) Mỡ cá tra, b) Đầu cá hồi, c) Hạt Chia
Qua hình 4.12 cĩ thể thấy được thành phẩm thu được cĩ màu sáng hơn, trong hơn so với mỡ lỏng sạch thu được đầu cá hồi, mỡ cá tra và dầu thơ ban đầu. Tuy nhiên màu sắc của thành phẩm Omega-3 được trích từ các nguồn nguyên liệu khác nhau sẽ mang màu sắc đặc trưng của nguồn nguyên liệu ban đầu. Sự thay đổi màu sắc của các sản phẩm qua giai đoạn thu nhận hỗn hợp acid béo tự do và làm giàu Omega-3 là do mỡ