Được dựa trên khả năng đặc biệt của urea khi tạo phức kết tinh với các acid béo bão hịa và acid béo bất bão hịa một nối đơi (điều này khơng xảy ra đối với các acid béo bất bão hịa đa nối đơi). Việc phát hiện ra khả năng tạo phức kết tinh của urea với các hợp chất hydrocarbon mạch thẳng trong dung mơi ethanol hoặc methanol được thực hiện bởi Bengen et al., 1940. Phát hiện này được xem như là cuộc cách mạng trong cơng nghiệp hĩa học dầu và mỡ. Kỹ thuật này rất hiệu quả trong việc làm tinh sạch các acid béo khơng no đa nối đơi từ dầu và mỡ. Trong suốt thời gian nghiên cứu về sữa tác giả đã chỉ ra rằng urea cùng với ethanol hoặc methanol tạo tinh thể với các hợp chất mạch thẳng nhưng khơng tạo tinh thể với các hợp chất cĩ mạch nhánh hoặc mạch vịng. Sau đĩ ơng đã khái quát hĩa hiện tượng này tới các hydrocarbon, các acid béo, các ester, các rượu, các aldehyde và ketone (Klinkesorn, 2004).
Theo Zhang et al., 2006 đây là phương pháp tách các acid béo bão hịa và acid béo bất bão hịa một nối đơi ra khỏi acid béo bất bão hịa đa nối đơi dựa trên nguyên tắc acid béo bão hịa và acid béo bất bão hịa một nối đơi thì khơng tạo phức kết tủa urea. Để thực hiện phản ứng tạo phức triệt để giữa urea với acid béo bão hịa, acid béo bất bão hịa một nối đơi thường sử dụng một trong các dung mơi hữu cơ để hịa tan cả urea và acid béo như methanol, ethanol hoặc 2-propanol vì khi đĩ cĩ sự hiện diện methyl ester hĩa acid béo hình thành tinh thể lục giác cĩ lỗ rỗng ở giữa, với lỗ rỗng này một vài acid béo bất bão hịa một nối đơi cĩ thể lọt vừa. Trong quá trình thực hiện phản ứng sẽ hình thành phức và kết tủa xuống trong khi các acid béo Omega-3 cĩ độ tinh khiết cao hơn nhiều so với hỗn hợp ban đầu bằng cách cất thu hồi dung mơi. Do tính chất hĩa học của urea tan tốt trong nước nên trong quá trình làm giàu dễ dàng loại được urea ra khỏi hỗn hợp acid béo Omega-3 bằng phương pháp rửa. Tiếp đĩ hỗn hợp acid béo Omega-3 làm khơ bằng muối khan.
2.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC, ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU
Trên thế giới, quá trình sản xuất Omega-3 đã được thực hiện với nhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp tách phân đoạn bằng li tâm phân tử (molecular centrifugal) (Stout, 1963), phương pháp sắc ký khí định lượng (preparative scale gas chromatography) (Hardy and Keay, 1967), phương pháp sắc ký cột (column chromatography) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2001), phương pháp CO2 siêu tới hạn (supercritical carbon dioxide), phương pháp trích ly bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid extraction – SFE) (Ưzden., 2003), … Cùng với cơng nghệ tách chiết
26
dầu đi đơi cùng với nĩ là cơng nghệ tinh luyện dầu cũng được phát triển. Trong đĩ, một số phương pháp điển hình sử dụng một tác nhân vật lý hay sinh học để phá hủy màng tế bào, từ đĩ giải phĩng ra dầu như: Phương pháp dùng nhiệt, phương pháp dùng lực cơ học (xay, nghiền, ép, li tâm), phương pháp đơng đá và tan đơng, phương pháp chiết dầu bằng dung mơi hữu cơ như benzen, xăng nhẹ, n-hexan…, phương pháp sinh học sử dụng enzyme hoặc các vi sinh vật (Luthria, 2004; Hayes, 2012). Trong nghiên cứu này, phương pháp trung hịa được sử dụng với mục đích là tách các acid béo tự do ra khỏi dầu mỡ dưới dạng muối kiềm bởi vì phương pháp trung hịa là dựa vào sự tác dụng của dung dịch kiềm lên các acid béo tự do và các tạp chất cĩ tính acid sẽ tạo thành các muối kiềm khơng tan trong dầu nhưng cĩ thể tan trong nước nên cĩ thể được tách ra bằng cách lắng hay rửa nhiều lần. Nhờ đĩ chỉ số acid của dầu giảm và cịn cĩ thể loại được một số tạp chất khác (Ciriminna et al., 2017; Nguyễn Quang Lộc et al., 1993).
Để tăng hàm lượng acid béo bất bão hịa đa nối đơi (Omega-3) trong hỗn hợp acid béo tự do thì cần tiến hành làm giàu hợp chất này. Vì vậy lựa chọn phương pháp để làm giàu Omega-3 trong hỗn hợp acid béo tự do cũng là một khâu quan trọng trong giai đoạn sản xuất Omega-3 vì phương pháp được lựa chọn khơng chỉ ảnh hưởng đến sản lượng mà cịn ảnh hưởng đến chất lượng của thành phẩm. Một trong những phương pháp làm giàu Omega-3 đang được dùng phổ biến hiện nay là phương pháp tủa urea. Hỗn hợp acid béo khi tạo phức với urea ở nhiệt độ thấp sẽ chia làm 2 pha: pha rắn chủ yếu chứa acid béo bão hịa và acid béo bất bão hịa một nối đơi và pha lỏng chứa acid béo bất bão hịa đa nối đơi khơng tạo phức với urea vì vậy mà cĩ thể dễ dàng tách ra khỏi hỗn hợp. Phương pháp này sử dụng cơng nghệ đơn giản, phù hợp cho điều kiện nghiên cứu của phịng thí nghiệm mà nhiều cơng trình trong và ngồi nước đã dùng và trích ly được lượng Omega-3 đáng kể như đề tài của Silva et al., 2016; Raviyan et al., 2016; Đinh Thị Thu Trang et al., 2015; Bùi Quang Thuật et al., 2014; Phạm Thị Lệ Thu và Phạm Thị Lan Phương, 2013).
Tại Việt Nam, cá tra rất phổ biến ở khu vực Đồng Bằng Sơng Cửu Long và cũng là nguồn nguyên liệu cho chế biến xuất khẩu. Tuy nhiên các phụ phẩm như: đầu, xương, mỡ, da... chiếm 65-70% trong chế biến philê cá tra chưa được tận dụng một cách hiệu quả (Lê Thị Thanh Xuân et al., 2018). Vì vậy nhĩm tác giả Phạm Thị Lệ Thu và Phạm Thị Lan Phương đã bước đầu thử nghiệm trích ly Omega-3 từ mỡ cá tra vào năm 2013. Tác giả đã sử dụng thành cơng các phương pháp như: tách chiết mỡ lỏng từ mỡ cá tra ban đầu bằng cách gia nhiệt gián tiếp mỡ cá ở 80oC, thủy giải để chiết tách các acid béo tự do ra khỏi mỡ cá trong dung dịch NaOH 0,5 M bằng phương pháp siêu âm hĩa với thời gian 1 giờ 30 phút, tủa urea để loại bỏ các acid béo bão hịa, thu hồi các acid béo bất bão hịa từ 5 g acid béo tự do với tỉ lệ urea/ethanol là 1/10 (g/mL). Kết quả thu được hàm lượng Omega-3 là 19,523 g/100 g (Phạm Thị Lệ Thu và Phạm Thị Lan Phương, 2013). Ngồi ra, nghiên cứu của Lê Thị Thanh Xuân (2018) đã khảo sát thành phần Omega-3, 6, 9 từ cá tra ở Đồng bằng sơng Cửu Long. Trong đĩ, từ 50 g mỡ cá tra thực
27
hiện chiết với dung mơi methanol thu được thành phần Omega-3 là 1,331 g/100 g (Lê Thị Thanh Xuân và et al., 2018).
Bên cạnh đĩ, cá hồi và hạt Chia cũng là hai nguồn nguyên liệu cĩ hàm lượng Omega-3 khá dồi dào nhưng giá khá đắt tại Việt Nam. Vì vậy tùy thuộc từng loại nguyên liệu và điều kiện phịng thí nghệm ở Việt Nam mà nghiên cứu này đã sử dụng các thiết bị cĩ sẵn tại phịng thí nghiệm của trường đại Kỹ thuật – Cơng nghệ Cần thơ để trích ly dầu thơ đối với nguyên liệu hạt Chia như trích ly bằng Soxhlet như các cơng trình của Campos et al., 2014; Ixtaina et al., 2008 mà khơng sử dụng các thiết bị đắc tiền, phức tạp như các nghiên cứu khác đã sử dụng: Villanueva-Bermejo et al., 2019; Dąbrowski, et al., 2018; Silva et al., 2016. Mặt khác, hai tác giả Campos và Ixtaina đều sử dụng dung mơi n-hexan trong các thí nghiệm khảo sát nhưng Campos thì dùng lượng dung mơi khá nhiều là 2,5 lít n-hexan để trích 650 g hạt Chia trong 4 giờ, cịn Ixtaina thì chỉ dùng 40 g hạt Chia cho một nghiệm thức nhưng thời gian trích ly khá dài là 8 giờ. Đối với nguyên liệu là cá hồi thì đề tài chỉ nghiên cứu trên đầu cá hồi bởi vì chi phí tương đối thấp hơn phần phi lê cá mà cịn tận dụng lượng phụ phẩm từ các cơ sở chế biến philê cá hồi. Do đĩ nghiên cứu đã lựa chọn phương pháp gia nhiệt đầu cá hồi với nước kết hợp với khuấy trộn để tách chiết phần mỡ lỏng trong nguyên liệu (Dave et al., 2014) mà khơng dùng phương pháp tách lipid bằng cách thủy phân với xúc tác lipase để tăng hàm lượng acid béo khơng bão hịa đa Omega-3 (PUFAs) như nghiên cứu của Xu et al., 2010. Vì vậy đối với hai nguyên liệu đắt tiền là hạt Chia và đầu cá hồi thì nghiên cứu này đã tiến hành thí nghiệm lựa chọn dung mơi, phương pháp trích ly cũng như điều kiện trích ly để phù hợp với điều kiện tại phịng thí nghiệm mà lại cĩ hiệu quả kinh tế và cĩ hiệu suất thu hồi sản phẩm cao nhất.
28
Chương 3: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu
- Quy trình trích ly Omega-3 từ hạt Chia. - Quy trình trích ly Omega-3 từ mỡ cá tra. - Quy trình trích ly Omega-3 từ đầu cá hồi.
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu
Phịng thí nghiệm chế biến thực phẩm, khoa Cơng nghệ thực phẩm và Cơng nghệ sinh học, Trường đại học Kỹ thuật – Cơng nghệ Cần Thơ.
3.1.3 Phương tiện nghiên cứu
3.1.3.1 Bảo quản nguyên liệu và chuẩn bị mẫu
Nguyên liệu: Đầu cá hồi và hạt Chia Xuân An được mua tại các siêu thị nội thành Thành phố Cần Thơ. Mỡ cá tra được thu mua ở cơng ty TNHH Hùng Cá tại KCN Thanh Bình, đường Quốc lộ 30, Thanh Bình, Tỉnh Đồng Tháp.
Đối với nguyên liệu là mỡ cá tra: Mỡ cá mua về sẽ được xử lý bằng cách rửa loại bỏ máu, tạp chất. Sau đĩ cho vào túi ni lơng với khối lượng mỡ cá mỗi gĩi là 300 g và bỏ tất cả các mẫu vào hộp nhựa. Để tránh làm ảnh hưởng đến chất lượng của mỡ cá trong thời gian thực hiện đề tài nên mỡ cá sẽ đem bảo quản vào tủ đơng ở nhiệt độ -15oC tại phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ thực phẩm và Cơng nghệ sinh học. Mẫu được rã đơng tự nhiên trước 30 phút trước mỗi lần làm thí nghiệm.
Đối với nguyên liệu là đầu cá hồi: Đầu cá sau khi mua về rửa sạch, sau đĩ cắt nhỏ và cho vào túi ni lơng với khối lượng đầu cá mỗi gĩi là 300 g và bỏ tất cả các mẫu vào hộp nhựa. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ 0°C tại phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ thực phẩm và Cơng nghệ sinh học. Trước khi thực hiện thí nghiệm lấy số lượng mẫu cần làm thí nghiệm đã làm đơng tiến hành rã đơng (Với cách xử lý này cá vẫn giữ được độ tươi, màu sắc, chất lượng của cá và bảo quản được lâu dài).
Đối với nguyên liệu là hạt Chia: Hạt Chia mua trước khi trích ly sẽ đem xay để làm nhỏ hạt, sau đĩ sẽ được sấy và đĩng thành từng gĩi, mỗi gĩi 20 g. Để tránh sự hút ẩm từ mơi trường vào nguyên liệu, mỗi gĩi sẽ được hút chân khơng và được bảo quản ở nhiệt độ phịng.
29
Bảng 3.1:Một số thiết bị và dụng cụ sử dụng
Tên thiết bị Dụng cụ thủy tinh
Bể điều nhiệt (Memmert, WNB14) Cốc thủy tinh 250 ml, 100 ml và 50 ml
Cân phân tích 2 số Bình tam giác 250 ml, 500 ml
Cân phân tích 4 số Bình định mức 1000 ml, 500 ml và 250 ml
Máy khuấy từ cĩ gia nhiệt(VELP) Bình lĩng và giá đỡ Máy ly tâm thường (Hettich, EBA
21, cat.no.1004)
Ống đĩng 100 ml Máy cơ quay chân khơng lạnh
(Biobase RE-100Pro)
Pipet 20 ml, 10 ml, 5 ml và quả bĩp cao su
Hệ thống chiết Soxhlet Buret 25 ml, 10 ml
Tủ đơng (BDF-40H485) Ống nhỏ giọt thủy tinh
Tủ hút Nhiệt kế
Tủ lạnh (Samsung RS62R5001M9/SV)
Tủ sấy (Memmert, UN 110) Hệ thống phân tích đạm: - Bộ vơ cơ hĩa mẫu (8 vị trí) - Bộ hấp thu acid
- Bộ chưng cất đạm Tủ nung
Bể siêu âm (King Plating, KPC-06L)
Bảng 3.2: Một số hĩa chất sử dụng
Tên hĩa chất Xuất xứ
Ethanol Trung Quốc
Ether dầu hỏa n-hexan Isopropanol
Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc
Urea Trung Quốc
Acid acetic Trung Quốc
Chloroform Trung Quốc
Thuốc thử wijs Đức
Hồ tinh bột Trung Quốc
Ether ethylic Trung Quốc
Phenolpthalein Trung Quốc
Sodium hydroxide Trung Quốc
Potassium hydroxide Trung Quốc
Sulfuric acid Trung Quốc
Boric acid Trung Quốc
Sodium sulfate Trung Quốc
Sodium thiosulfate Trung Quốc
Potassium sulfate Trung Quốc
Copper(I) sulfate Trung Quốc
Hydrochloric acid Trung Quốc
Carbon tetrachloride Trung Quốc
30
3.2PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Các phương pháp phân tích
Các phương pháp phân tích thành phần nguyên liệu và của sản phẩm được thể hiện ở bảng 3.3. Mỗi thí nghiệm phân tích lặp lại 3 lần, giá trị biểu thị là giá trị trung bình.
Bảng 3.3:Các phương pháp phân tích STT Chỉ tiêu Phương pháp 1 Chỉ số acid TCVN 6127:2010 2 Chỉ số peroxide TCVN 6121:2010 3 Chỉ số iod TCVN 6122:2015 4 Hàm lượng nước TCVN 6120:2007
5 Hàm lượng protein Phương pháp chưng cất đạm Kjeldalh
6 Hàm lượng lipid tổng Phương pháp Soxhlet
7 Hàm lượng tro tổng số TCVN 5611:2007
8 Xác định thành phần Omega-3 CASE.SK.0107 – GC*
Ghi chú: * mẫu được phân tích tại Trung tâm dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TP.HCM chi nhánh Cần Thơ
3.2.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với nguồn nguyên liệu cố định và được thực hiện 3 lần lặp lại ở mỗi chỉ tiêu. Các thí nghiệm được bố trí và tiến hành thực hiện qua ba giai đoạn chính:
3.2.2.1 Thí nghiệm trích ly mỡ lỏng từ mỡ cá tra và đầu cá hồi, dầu thơ từ hạt Chia
Đối với mỡ cá tra: Mỡ cá tra được rã đơng tự nhiên, sau đĩ dùng dao băm nhỏ mỡ, cân 30 g mỡ băm cho vào cốc thủy tinh 50 mL, tiến hành gia nhiệt gián tiếp bằng bể điều nhiệt ở các nhiệt độ khảo sát 70oC, 80oC và 90oC trong thời gian khảo sát 20 phút, 40 phút và 60 phút, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục cho mỡ tan đều, tiếp đến cho mỡ cá đã được hĩa lỏng vào vải lọc để loại bỏ phần cặn khơng tan, thu được mỡ lỏng sạch.
Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất thu hồi mỡ lỏng sạch (%).
Hiệu suất thu hồi mỡ lỏng sạch (%) = Khối lượng sản phẩm thu được (g)
Khối lượng lipid tổng trong nguyên liệu (g)× 100% (3.1)
Đối với đầu cá hồi: Đầu cá hồi sau khi được ra đơng, xay nhỏ rồi cân 100 g đầu cá đã xay cho vào cốc 500 mL. Cho thêm nước cất vào theo tỉ lệ 1:1. Tiến hành đun hỗn hợp vừa xay trên bếp điện từ ở nhiệt độ 80 - 85oC (theo dõi nhiệt độ trong thời gian đun bằng nhiệt kế) trong 15 phút, 30 phút, 45 phút với tốc độ khuấy từ lần lượt là 100 vịng/phút, 300 vịng/phút, 500 vịng/phút. Sau đĩ lọc bỏ bã thu được dung dịch mỡ cá. Tiếp theo, cân khối lượng dung dịch thu được (150 g), chia ra từng mẫu nhỏ cho vào ống ly tâm 50 mL sao cho khối lượng các ống ly tâm bằng nhau để tránh làm lệch tâm máy ly tâm và tiến hành ly tâm với điều kiện máy ly tâm là nhiệt độ ở 4℃, thời gian 15 phút, tốc độ (4500 vịng/phút), sau đĩ thu lấy lớp mỡ cá phía trên (lớp mỡ cá lỏng).
31
Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất thu hồi mỡ cá lỏng (%).
Hiệu suất thu hồi mỡ cá lỏng (%) = Khối lượng sản phẩm thu được (g)
Khối lượng lipid tổng trong nguyên liệu (g)× 100% (3.2)
Đối với hạt Chia: Tiến hành trích ly 20 g mẫu hạt Chia đã chuẩn bị sẵn trong mỗi gĩi cùng với 200 ml lần lượt các dung mơi là ether dầu hỏa, n-hexan và isopropanol bằng hệ thống Soxhlet, bể siêu âm và máy khuấy từ cĩ gia nhiệtở nhiệt độ 55oC trong 90 phút. Khi quá trình trích ly hồn thành tiến hành cơ quay chân khơng hỗn hợp để thu được dầu thơ và thu hồi dung mơi.
Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất thu hồi dầu thơ (%).
Hiệu suất thu hồi dầu thơ (%) = Khối lượng sản phẩm thu được (g)
Khối lượng lipid tổng trong nguyên liệu (g)× 100% (3.3)
3.2.2.2 Thí nghiệm thu nhận hỗn hợp acid béo tự do bằng phương pháp thủy phân hĩa học hĩa học
Cho 2 g mỡ lỏng và 12 ml ethanol tuyệt đối vào bình tam giác 250 ml, lắc cho tan đều, sau đĩ bổ sung lượng NaOH 3,85% (40 g/L) ở các lượng khảo sát lần lượt là 2Kdd, 3Kdd và 4Kdd vào hỗn hợp, đậy kín miệng bình để tránh cho ethanol bay hơi. Đặt bình vào bể siêu âm và tiến hành siêu âm hĩa ở nhiệt độ 75oC cho đến khi hỗn hợp tan hồn