- giá trị ựối với một tập hợp tắnh trạng
4. Vật liệu và phương pháp xử lý ựột biên 1 Chọn kiểu gen
4.1 Chọn kiểu gen
Việc chọn lọc giống nào/dòng nào ựể xử lý ựột biến phụ thuộc vào tắnh trạng cần cải tiến. Chẳng hạn, ựể giảm hàm lượng a xit linolenic ở ựậu tương xuống 3% thì xử lý vật
liệu nhập nội nhập nội tuy kém thắch ứng nhưng hàm lượng chỉ 5% sẽ có xác xuất cao hơn so với các giống tốt nhất có hàm lượng tới 8%.
Thông thường nhà chọn giống chọn các giống tốt nhất cần phải cải tiến một tắnh trạng nào ựó. Trong một số trường hợp nhà chọn giống sử dụng con lai F1 vì cùng lúc hai bộ gen khác nhau ựược tiếp xúc với tác nhân ựột biến và qua ựó có thể làm tăng tần số tái tổ hợp.
4.2 Chọn vật liệu xử lý
Tuỳ từng loại cây trồng các bộ phận xử lý có khác nhau. - Cả cây: cây con, loại cây nhỏ
- Hạt: là vật liệu dùng ựể xử lý phổ biến nhất vì hạt chịu ựược các tác ựộng vật lý như ngâm nước, phơi khô, sấy nóng.
- Hạt phấn
- Các bộ phận sinh dưỡng: cành giâm, mắt, ựỉnh sinh trưởng. - Tế bào trong nuôi cấy
đối với cây sinh sản bằng hạt, xử lý hạt khô bằng tác nhân vật lý thuận tiện và thực tế nhất. Hạt giống phải ựại diện cho giống (ựồng nhất, hạt tác giả, hạt siêu nguyên chủng). Tuy nhiên trở ngại là hạt là một cấu trúc ựa bào nên sự kiện ựột biến xảy ra ở một hoặc ắt tế bào sẽ dẫn ựến sự hình thành thể khảm ở cây thế hệ ựầu sau khi xử lý (M1). Hơn nữa ở cây thể khảm M1 xảy ra quá trình chọn lọc lưỡng bội và ựơn bội.
Bảng 5.8: Tác nhân ựột biến và liều lượng xử lý ở một số cây trồng.
Cây trồng Vật liệu xử lý Tác nhân Liều lượng
A. Cây sinh sản bằng hạt
Lúa mì Hạt khô Tia Gamma
Trung tử nhanh EMS
10-25 krad 600-800 rad 3,76%
Lúa nước Hạt khô Tia X 14-28 krad
Ngô Hạt khô Tia Gamma 0,6 -2 krad
Lạc Hạt khô Tia Gamma 20-30 krad
đậu tương Hạt khô Tia Gamma 10-20 krad
Cà chua Hạt khô EMS 0,8%
Hồ tiêu Hạt khô Trung tử nhanh
Tia Gamma 2,4 krad 14-22 krad B. Cây sinh sản vô tắnh
Khoai tây Củ EMS 100-500 ppm
Mắa Hom một mắt Tia Gamma 2-6 krad
Khoai lang Hom Tia Gamma
Ethylenimin 20 krad 0,5%
Cà phê hạt khô Tia Gamma 2,5-20 krad
Cam qúyt Hạt khô
Mắt Tia Gamma 1-2,5 krad 5 krad
ườ đạ ọ ệ ộ ọ ố ồ 84
đối với cây sinh sản vô tắnh vật liệu xử lý phải sạch bệnh. Có thể xử lý các bộ phận nhân giống, như mắt ghép, cành ghép, hom hay cành giâm, củ, gié hành hay mẫu mô cắt (ựỉnh sinh trưởng, biểu bì, bầu, tầng nuôi, v.v.). Các cơ quan này cũng chứa nhiều tế bào và sau khi xử lý sẽ tạo thành cấu trúc khảm gồm các tế bào có ựặc ựiểm di truyền khác nhau ở dạng hình quạt trong tầng sinh mô (khảm hình quạt). Thông thường khảm hình quạt tạo thành ở thế hệ VM1 có thể chuyển thành khảm vòng với một lớp tế bào ựột biến ựồng nhất. để tạo ựiều kiện hình thành và thu ựược cây ựột biến không mang thể khảm có thể áp dụng một số kỹ thuật sau ựây:
i) Tỉa hoặc cắt cành sơ cấp và sử dụng mầm nách ựể nhân
ii) Lấy mắt nhiều lần của những mầm hình thành từ thuỳ nguyên thủy ở phần dưới và phần giữa của cành VM1.
iii) Nhân cây ựột biến ựồng nhất thông qua mầm nách trong ựiều kiện in vitro
iv)Áp dụng kỹ thuật mầm bất ựịnh. Mầm bất ựịnh thường phát triển từ một tế bào và vì thế mầm bất ựịnh nếu hình thành từ lá, thân hay cành giâm ựột biến sẽ tạo ra cây ựột biến ựồng nhất không có thể kảm. Nhược ựiểm của kỹ thuật này là không thể áp dụng với tất cả các loài.
Xử lý hạt phấn của cây lưỡng bội tương tự như xử lý các thể ựơn bội. Mọi ựột biến ở hạt phấn ựều truyền lại cho thế hệ con cái, nếu hạt phấn tham gia vào quá trình thụ tinh và hợp tử hình thành hạt. Những cây hình thành ở thế hệ M1 phân biệt với nhau bởi gen ựột biến, còn trong từng cây mọi tế bào, mô và cơ quan ựều ựồng nhất về di truyền, không có thể khảm (Hình 1.8).
M1
4.3 Phương pháp xử lý
Xử lý bức xạ ion hoá
để xử lý bằng bức xạ, hạt hoặc các bộ phận sinh dưỡng, cây con, hoa, bao phấn, hạt phấn ựược ựặt dưới nguồn chiếu. Hạt ựược tải ra thành lớp mỏng. Trong quá trình xử lý hat phải trộn và các bộ phận của cây phải ựảo nhiều lần và tuân thủ ựiều kiện bảo hộ lao ựộng. Thời gian chiếu phụ thuộc vào công suất của nguồn và liều lượng cần xử lý, công suất nhỏ thời gian xử lý dài, ngược lại công suất lớn thời gian xử lý ngắn.
độ ẩm của hạt có ý nghĩa quyết ựịnh ựối với tác ựộng ựột biến của tia vì ựộ ẩm ảnh hưởng trực tiếp tới trạng thái sinh lý. Phơi khô cũng như tăng thủy phần của hạt ựều làm tăng tác ựộng cuả tia bức xạ. Do ựó hạt nên ựược xử lý ở ựộ ẩm nhất ựịnh và tiêu chuẩn hoá, ựể có thể lặp lại kết quả. Ngoài ra nhiệt ựộ và ô-xy của hạt và của không khắ cũng ảnh hưởng tới kết quả xử lý.
Hạt phấn
A A a A a a
AA Aa AA Aa AA
Giao tử cái Giao tửựực
Bên cạnh việc xử lý hạt và các cơ quan sinh sản sinh dưỡng, xử lý hạt phấn cũng ựược quan tâm. Ưu ựiểm của xử lý hạt phấn là khi tham gia vào quá trình thụ tinh hạt phấn truyền cho thế hệ con tất cả những ựột biến. Tiến hành xử lý 4-7 ngày trước khi tung phấn, bằng cách cắt cành hoa cắm vào bình nước ựặt dưới nguồn chiếu. Liều lượng xử lý thấp hơn nhiều so với liều lượng tối ưu của hạt, vì hạt phấn có hàm lượng thủy phần cao mẫn cảm với tia hơn. Liều lượng có hiệu lực thường biến ựộng trong khoảng 0,5 ựến 2 krad ựối với tia X và tia gamma. Sau khi xử lý hạt phấn ựược dùng ựể thụ phấn cho cây mẹ.
Với tia bức xạ có thể xử lý nhanh (trong thời gian ngắn từ vài phút ựến vài giờ) hoặc xử lý lâu dài trong trường gamma (từ nhiều tuần trở lên với cường ựộ thấp). Cũng có thể xử lý gián ựoạn, trong ựó tổng liều lượng xử lý ựược thực hiện bằng cách xử lý ngắt quảng cách nhau một khoảng thời gian nhất ựịnh.
Xử lý tác nhân hoá học
Xử lý các chất hoá học thường diễn ra trong dung dịch. Vì tác nhân ựột biến hoá học rất ựộc và có thể gây ung thư nên phải thực hiện các biện pháp bảo hộ nghiêm ngặt. Hạt (hay các bộ phân sinh dưỡng) ựược ngâm (hay nhúng) trong dung dịch một thời gian nhất ựịnh. Thông thường ựể ựạt hiệu quả cao và có thể lặp lại kết quả, xử lý tác nhân hoá học ựược tiến hành theo nhiều bước: làm trương hạt trong nước, xử lý, rửa sạch, phơi khô hạt. Riêng với Natri azid hạt có thể xử lý và gieo ngay mà không cần làm trương hay rửa sau khi xử lý. Khi xử lý tác nhân hoá học, tác ựộng của tác nhân ựột biến cũng bị ảnh hưởng bởi trạng thái sinh lý của các bộ phận xử lý. Trong các ựiều kiện ảnh hưởng, nhiệt ựộ và pH dung dịch ựóng vai trò quan trọng bậc nhất. Liều lượng xử lý là kết quả của nồng ựộ và thời gian xử lý. Cả hai yếu tố ựều có thể xác ựịnh ựối với từng tác nhân, từng loài hay từng giống cây trồng thông qua thắ nghiệm sơ bộ. Thời gian phân giải hay bán rã của tác nhân ựột biến thường ngắn nên thời gian xử lý ựột biến nằm trong khoảng từ 8 ựến 16 giờ.
Nhiệt ựộ xử lý xung quanh 20oC, thể tắch dung dịch tốt nhất gấp 10 lần thể tắch hạt ựược xử lý. Sau khi xử lý hạt phải ựược rửa sạch ựể loại bỏ các chất phân giải do thuỷ phân. Thời gian rửa phụ thuộc vào tác nhân xử lý và tốt nhất nên rửa nhiều giờ dưới vòi nước chảy.
Hiệu quả và hiệu suất xử lý
Hiệu quả = số ựột biến tạo ra trên một ựơn vị liều lượng (vắ dụ trên cường ựộ ựo bằng Gy hay số miligram hóa chất trong lắt x thời gian xử lý)
Hiệu suất = tỉ số giữa thay ựổi (ựột biến) mong muốn với hệ quả không mong muốn (như cây bị bất dục hoặc chết) = số ựột biến (số ựột biến diệp lục) trên 100 bông M1 (hoặc 100 cây con M2) chia cho tỉ lệ cây bị tổn thương, chết hoặc bất dục.