2.1.1- Cỏc quan niệm về gen
Thuật ngữ "gen" được Johansen nờu ra vào năm 1909 để chỉ nhõn tố di truyền xỏc định một tớnh trạng nào đú. Vị trớ và cấu trỳc của gen đó được Morgan và cỏc nhà khoa học xỏc định và ngày càng làm rừ thờm.
Giai đoạn trước năm 1953, khi cấu trỳc của phõn tử DNA chưa được khỏm phỏ thỡ cấu tạo của gen cũng chưa được xỏc định, tuy nhiờn cỏc nhà khoa học đó khẳng định rằng, gen là một đơn vị di truyền, mỗi một gen xỏc
định một tớnh trạng, cú một vị trớ nhất định trờn nhiễm sắc thể và gen cú thể
phõn chia nhỏ về mặt tỏi tổ hợp và đột biến.
Năm 1941, Beadle và Tatum đó xỏc định rằng, gen kiểm tra hoạt tớnh của enzyme và nờu ra giả thuyết là: mỗi gen kiểm soỏt sự tổng hợp một enzyme. Giả thuyết này về sau được mở rộng và cụ thể húa hơn là: mỗi gen kiểm soỏt sự tổng hợp một chuỗi polypeptide. Vớ dụ, một phõn tử enzyme
được cấu tạo từ hai sợi polypeptide thỡ sẽ do hai gen xỏc định.
Sau khi Watson và Crick xỏc định được cấu trỳc DNA thỡ cấu tạo của gen cũng ngày càng được làm rừ hơn.
Hiện nay, cấu tạo và chức năng của một gen được xỏc định như sau: - Gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptide hay một RNA. Mỗi gen cú cấu tạo gồm ba vựng (region) cú chức năng riờng biệt là: vựng trước, vựng sau và vựng mó húa. Vựng trước làm nhiệm vụ điều hành, vựng trước và vựng sau khụng mó húa cho cỏc axit amin. Trong vựng mó húa
ở tế bào sinh vật eucaryote cú những đoạn mang mó cho cỏc axit amin gọi là exon xen kẽ với những đoạn khụng mang mó gọi là intron. Mỗi gen chiếm một vị trớ (locus) nhất định trờn nhiễm sắc thể và xỏc định một tớnh trạng nhất
định. Gen cú thể bị chia nhỏ bởi cỏc đơn vịđột biến và tỏi tổ hợp.
2.1.2- Cấu trỳc của gen
Mỗi một gen cú cấu tạo tổng quỏt gồm ba vựng chớnh: vựng điều khiển (vựng trước), vựng mang thụng tin di truyền (vựng mó húa) và vựng kết thỳc (vựng sau). Vựng điều khiển nằm ở đầu 3’ và vựng kết thỳc nằm ở đầu 5’ của sợi DNA làm khuụn (coding strand hoặc sense) để phiờn mó. Tuy nhiờn, khi ghi sơ đồ của một gen bất kỳ nào đú vào ngõn hàng gen, người ta đều lấy sợi DNA khụng làm khuụn (antisense) vỡ trỡnh tự sắp xếp cỏc bazơ trong sợi antisense giống như trỡnh tự sắp xếp cỏc bazơ trong sợi RNA sau khi phiờn mó. Do đú, cú thể núi vựng điều khiển nằm ở đầu 5’ và vựng kết thỳc nằm ở đầu 3’ của gen. Vựng điều khiển và vựng kết thỳc khụng mang mó cho cỏc axit amin trong quỏ trỡnh tổng hợp protein. Ngoài ra, trong một gen cũn cú thể
cú một số cấu trỳc đặc thự khỏc, cú vị trớ khụng xỏc định như trỡnh tự tăng cường (enhance), trỡnh tự bất hoạt (silencer),...
Sơđồ cấu trỳc chung của một gen cú thể biểu diễn như sau:
vựng mang thụng tin di truyền
5' R P O 3' vựng điều khiển vựng kết thỳc R: Trỡnh tự điều hoà P: Promoter O: Operator
Vựng điều khiển khụng được phiờn mó mà cú chức năng giỳp enzyme RNA-polymerase thực hiện sự phiờn mó chớnh xỏc.
2.1.2.1- Cấu trỳc của promoter
Promoter là trỡnh tự nhận biết của enzyme RNA-polymerase và là nơi mà enzyme RNA-polymerase gắn vào để xỏc định vị trớ bắt đầu phiờn mó. Do vậy nờn promoter cú những cấu trỳc đặc hiệu giỳp enzyme nhận biết chớnh xỏc.
Khảo sỏt nhiều promoter khỏc nhau của cỏc gen, người ta nhận thấy phần tõm của promoter cú những trỡnh tự chung giống nhau và gọi là cỏc hộp, vớ dụ ở E. Coli cú hộp TATAAT. Hộp này thường nằm ở vị trớ khoảng −10,
tức là nằm ở khoảng 10 nucleotide phớa trước vị trớ khởi đầu phiờn mó hay trỡnh tự TTGACA nằm ở vị trớ −35, tức là khoảng 35 nucleotide trước vị trớ khởi đầu phiờn mó. Ở vi khuẩn cú một loại promoter vỡ chỉ cú một loại RNA- polymerase. CT G GAC A ACTGT TAAT TAGTAGCT TGATC ATAT TA T T T T G G A A A A A AA A AA A AGTAC CG AAGT TCATG GC T TCA T T T T T T T T T T T A A A A A A C CG C G C C 35 10 Vị trí khởi đầu phiên mã của RNA
Hỡnh 2-1: Vựng tõm promoter của operon Trp ở vi khuẩn
Ở tế bào eucaryote, vựng điều khiển thường lớn hơn ở tế bào procaryote. Eucaryote cú ba loại enzyme RNA-polymerase nờn chỳng cú ba loại promoter, mỗi loại ứng với một loại enzyme để chỳng dễ dàng nhận biết và bỏm vào đú để thực hiện phiờn mó. Promoter nhúm I là vị trớ bỏm của enzyme RNA-polymerase I, promoter nhúm II và nhúm III là vị trớ bỏm của enzyme RNA-polymerase nhúm 2 và nhúm III. Mỗi loại promoter cú những trỡnh tự chung giống nhau, cỏc trỡnh tự này định vịở những vị trớ xỏc định, do
đú, cỏc enzyme dễ dàng nhận biết và thực hiện phiờn mó chớnh xỏc. 2.1.2.2- Cấu trỳc vựng mang thụng tin di truyền
Ở tế bào sinh vật procaryote, cỏc gen được tổ chức theo dạng operon, nghió là, mỗi một gen mang mó để tổng hợp một số chuỗi polypeptide. Vựng mang mó để tổng hợp một polypeptide gọi là một cistron. Như vậy, gen ở tế
bào procaryote thuộc loại polycistron. Cỏc cistron sắp xếp theo từng nhúm, chung một vựng điều khiển tạo thành một operon. Cỏc protein được mó húa trong một operon thường cú liờn quan chặt chẽ với nhau trong một quỏ trỡnh chuyển húa sinh húa nào đú trong tế bào. Kiểu tổ chức bộ mỏy di truyền như
vậy giỳp vi khuẩn thớch nghi nhanh với những thay đổi của điều kiện ngoại cảnh mụi trường. Toàn bộ vựng mang thụng tin di truyền được mó húa cho cỏc polypeptide.
Vựng mang mó di truyền của sinh vật eucaryote cú cấu trỳc phức tạp hơn. Phần lớn cỏc gen cú chứa cỏc đoạn khụng mang mó (intron) nằm xen kẽ
với cỏc đoạn mang mó (exon). Chỉ cú một số ớt cỏc gen là khụng cú intron như một số gen mó húa cho protein histon. Ở nhiều gen, phần khụng mang mó (intron) cú tổng độ dài lớn hơn tổng độ dài của cỏc đoạn mang mó, như gen
mó húa cho albumin, conalbumin, ... Số lượng intron cú mặt trong cỏc gen cũng khụng giống nhau, vớ dụ như ở gen mó húa cho α-globin chỉ cú hai intron, trong khi đú, ở gen mó húa cho colagen lại cú đến 52 intron. Cỏc đoạn intron sẽ được cắt bỏ trong quỏ trỡnh phiờn mó. Điểm giao tiếp giữa intron và exon cú những dấu hiệu riờng biệt, đú là cỏc cặp bazơ GU và AG (...GU...AG...).
2.1.2.3- Cấu trỳc vựng kết thỳc
Vựng kết thỳc nằm ở đầu 5’ của sợi DNA làm khuụn (sense) - là đầu 3' của gen (sợi antisense), bao gồm những trỡnh tự khụng mó húa cho cỏc axit amin. Vựng này thường cú cỏc tớn hiệu dừng phiờn mó, giỳp enzyme RNA- polymerase dừng phiờn mó đỳng vị trớ. Ngoài ra, trong vựng này cũn cú một số trỡnh tự cú chức năng chưa rừ ràng.
2.2- SỰ SAO MÃ DNA(Replication)
Một trong những tớnh chất căn bản của DNA là khả năng tự sao chộp (replication) hay là tự nhõn đụi (self duplication). Nghĩa là từ một phõn tử
DNA mẹ sao chộp tạo ra hai phõn tử DNA con giống y như phõn tử DNA mẹ
ban đầu.
Sự tỏi bản DNA là một trong những tớnh chất quan trọng, nhờ đú mà thụng tin di truyền được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khỏc.
2.2.1- Lý thuyết về sao mó DNA theo khuụn
2.2.1.1-Giả thuyết của Watson - Crick
Sau khi xõy dựng mụ hỡnh cấu trỳc của phõn tử DNA, Watson và Crick
đó thấy rằng, nếu hai sợi DNA tỏch rời ra thỡ một sợi sẽ làm khuụn để tổng hợp một sợi mới vỡ do cỏc bazơ nitơ luụn cú xu hướng bắt cặp với nhau (A với T và G với C). Theo dự đoỏn của Watson và Crick, quỏ trỡnh tổng hợp DNA cú thể túm tắt như sau:
- Đầu tiờn liờn kết hydrụ sẽ bịđứt ra để tạo hai mạch đơn làm khuụn.
- Cỏc bazơ nitơ mới sẽ bắt cặp bổ sung với cỏc bazơ nitơ trờn sợi làm khuụn theo qui tắc A đối diện với T và G đối diện với C.
- Kết thỳc quỏ trỡnh sao mó, từ một sợi DNA xoắn kộp mẹ sẽ tạo hai sợi xoắn kộp con. Mỗi sợi xoắn kộp con cú một sợi mới tổng hợp và một sợi sẽ
làm khuụn.
Ngay sau khi mụ hỡnh được nờu ra, nhiều thớ nghiệm chứng minh đó
được tiến hành để xỏc nhận dự đoỏn.
2.2.1.2- Thớ nghiệm chứng minh của Meselson - Stahl (1958)
Thớ nghiệm này nhằm mục đớch chứng minh kiểu tổng hợp theo khuụn của DNA như dự đoỏn của Watson và Crick. Thớ nghiệm được thực hiện trờn
E. Coli. Vi khuẩn được nuụi cấy qua nhiều thế hệ trờn mụi trường cú chứa nitơđồng vị nặng N15 và nitơ thường N14.
Nguyờn tắc của thớ nghiệm là dựa trờn khả năng phõn biệt tỉ trọng của hai đồng vị N15 và N14 cú mặt trong cỏc loại DNA khi li tõm trờn thang nồng
độ CsCl2 . Quỏ trỡnh thớ nghiệm được tiến hành như sau:
- Thế hệ đầu (gọi là thế hệ 0): vi khuẩn được nuụi trờn mụi trường chứa N15 như vậy ở thế hệ này, cỏc nguyờn tử nitơ trong DNA của vi khuẩn sẽ là N15. Sau khi nuụi tiến hành tỏch DNA và đem li tõm trờn thang nồng độ CsCl2, nhận thấy:
+ Ở thế hệ 0: chỉ chứa 1 giải đơn cú tỉ trọng cao. Như vậy tất cả DNA của thế hệ cha mẹ đều chứa 2 sợi với nitơ nặng.
- Thế hệ 1: Chuyển vi khuẩn ở thế hệ 0 sang nuụi trờn mụi trường chứa N14. Thời gian và điều kiện nuụi tuơng tự như ở thế hệ 0. Sau khi tỏch DNA và đem li tõm nhưở thế hệ 0, thỡ thấy:
+ Ở thế hệ 1 chỉ chứa 1 giải đơn cú tỉ trọng trung bỡnh. Như vậy mỗi phõn tử con ở thế hệ 1 cú 1 sợi chứa nitơ nặng của bố mẹ và 1 sợi bổ sung mới tổng hợp cú cấu tạo từ nitơ nhẹ N14, gọi là sợi DNA lai.
- Thế hệ 2: Tiếp tục chuyển vi khuẩn của thế hệ 1 sang thế hệ 2 và cũng nuụi trờn mụi trường chứa N14. Quỏ trỡnh thớ nghiệm tiến hành tương tự như ở
cỏc thế hệ trờn. Sau khi li tõm, quan sỏt thấy cú một nửa số lượng phõn tử
DNA là phõn tử lai giống thế hệ 1 và một nửa số lượng cũn lại là phõn tử
DNA với cả hai sợi đều mang N14 (Hỡnh 2-2). - 42 -
Thế hệ 0: DNA nặng nuôi trên môi tr−ờng N15
Thế hệ 1: DNA lai nuôi trên môi tr−ờng N14
Thế hệ 2: Nuôi trên môi tr−ờng N14
Hỡnh 2-2: Mụ hỡnh thớ nghiệm của Meselson-Stahl
Thớ nghiệm trờn là một bằng chứng chứng minh giả thuyết của Watson và Crick là đỳng. Quỏ trỡnh tổng hợp DNA phải thực hiện theo khuụn, hai mạch ban đầu được tỏch ra, mỗi cỏi làm khuụn để tổng hợp mạch mới. Kết quả là, mỗi phõn tử con đều mang một mạch cũ và một mạch mới. Kiểu sao mó như vậy gọi là “sao mó bỏn bảo tồn” (semi-conservative).
2.2.1.3-Thớ nghiệm chứng minh của Arthur và Kornberg
Cũng trong năm này (1958), Arthur và Kornberg tại trường Đại học Washington đó tinh sạch một loại enzyme từ E. Coli, gọi là DNA-polymerase. Enzyme này xỳc tỏc tổng hợp một sợi polynucleotide từ cỏc nucleotide-3- phosphat.
Nguyờn liệu dựng cho thớ nghiệm gồm:
- Bốn loại nucleotide dạng triphosphat: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. - Enzyme DNA-polymerase chiết từ vi khuẩn E. Coli.
- Ion Mg+2 là cofactor của enzyme, tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của enzyme.
Tiến trỡnh thớ nghiệm cú thể mụ tả như sau:
Thớ nghiệm thứ nhất được tiến hành với đầy đủ cỏc nguyờn liệu như đó giới thiệu ở trờn, trong cỏc điều kiện thuận lợi cho sự tổng hợp sợi DNA mới, nhưng khụng cú sợi làm khuụn.
Thớ nghiệm thứ hai cũng được tiến hành tương tự như thớ nghiệm 1 nhưng cú một sợi DNA làm khuụn. Sợi làm khuụn được thu nhận bằng cỏch làm biến tớnh và tỏch mạch, sau đú đưa vào thớ nghiệm.
Họ thấy rằng, ở thớ nghiệm thứ nhất, enzyme DNA-polymerase khụng thể tổng hợp sợi DNA từ cỏc nguyờn liệu khi khụng cú mặt của sợi khuụn, việc tổng hợp sợi DNA mới chỉ xảy ra ở thớ nghiệm thứ hai, khi cú mặt DNA khuụn. Điều đú khẳng định rằng giả thuyết của Watson và Crick là đỳng. DNA được tổng hợp chỉ khi cú một sợi làm khuụn.
2.2.2-Quỏ trỡnh sao mó
2.2.2.1- Cỏc enzyme và protein đặc hiệu tham gia sao mó
Đõy là một quỏ trỡnh phức tạp, để thực hiện sao mó cần thiết phải cú mặt của cỏc enzyme, cỏc protein đặc hiệu và cỏc điều kiện cần thiết sau đõy:
1,- Liờn kết hydro giữa 2 mạch bổ sung của sợi DNA mẹ phải bị phỏ vỡ và tỏch rời từng bước làm 2 mạch để làm khuụn.
2,- Phải cú đoạn mồi (primer), tức đoạn RNA mạch đơn ngắn bắt cặp với mạch đơn DNA khuụn từ vị trớ bắt đầu của mỗi đoạn sao chộp.
3,- Cú đủ 4 loại nucleotide ở dạng triphosphat (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) để bắt cặp bổ sung với cỏc nucleotide mạch khuụn.
4,- Mạch mới được tổng hợp theo hướng 5’−P → 3’−OH.
5,- Mỗi bước được điều khiển bởi enzyme đặc hiệu và được thực hiện một cỏch nhanh chúng, chớnh xỏc.
6,- Cú mặt của ion Mg+2 làm cofactor của enzyme.
7,- Trong quỏ trỡnh sao chộp, ngoài cỏc enzyme đặc hiệu cũn cú cỏc protein đặc hiệu.
Cỏc enzyme và protein đặc hiệu tham gia sao chộp gồm cú:
- Enzyme topoisomerase, làm nhiệm vụ thỏo xoắn về hai phớa trờn sợi DNA kộp.
- Enzyme helicase, sử dụng năng lượng ATP để làm đứt liờn kết hydrụ giữa cỏc bazơ nitơ của hai mạch khuụn.
- DNA-polymerase I, -II, -III làm nhiệm vụ tổng hợp sợi mới và sửa sai. - RNA-polymerase, làm nhiệm vụ tổng hợp đoạn mồi.
- Enzyme primase, làm nhiệm vụ gắn mồi.
- Enzyme ligase, làm nhiệm vụ nối hai nucleotide đứng cạnh nhau bằng liờn kết phosphodiester để tạo mạch polynucleotide.
- Enzyme ribonuclease (RNase) làm nhiệm vụ cắt bỏ mồi sau khi tổng hợp xong mạch mới. C g C g C g g c A t t a t a A t t a g c C g C g C g C g G c T a A G A tAt At T a A t Cg Cg ta T C at Ta At At A t gc Cg Cg DNA con DNA mẹ
Hỡnh 2-3: Sao chộp theo quy luật bổ sung
Cỏc protein tham gia sao mó gồm cú:
- Protein B, nhận biết điểm khởi đầu (origin) sao chộp trờn sợi DNA kộp. - Protein SSB (Single Strand Buiding), làm nhiệm vụ giữ hai mạch của sợi DNA khụng cho chập vào nhau, tạo điều kiện thuận lợi cho quỏ trỡnh sao chộp.