- gen điều hoà operator
NHỮNG NGUYấN Lí CƠ BẢN CỦA CễNG NGHỆ DI TRUYỀN
CễNG NGHỆ DI TRUYỀN
Cụng nghệ di truyền cũn gọi là cụng nghệ DNA tỏi tổ hợp, đó và đang tiến hành một cuộc cỏch mạng sinh học. Nú ngày càng cú nhiều ảnh hưởng
đến y học lõm sàng, trong chăn nuụi, trồng trọt và nhiều lĩnh vực cụng nghệ
khỏc. Khi sử dụng cụng nghệ di truyền chỳng ta đó tạo ra protein của người với một lượng lớn cần thiết cho điều trị bệnh. Vớ dụ như insuline, hormone sinh trưởng người, chất hoạt húa plasminogen.
Cũng bằng cỏch này người ta đó tạo ra nhũng vaccine phõn tử để ngăn ngừa cỏc bệnh nhiễm virus như bệnh viờm gan B, hay để chuẩn đoỏn như
trong test phỏt hiện AIDS.
Về nguyờn lý cơ bản để thực hiện cụng nghệ di truyền cú nghĩa là phải thực hiện kỹ thuật DNA tỏi tổ hợp. Để tiến hành kỹ thuật này phải trải qua nhiều bước phức tạp và tinh vi sau đõy:
- Bước 1: Tỏch chiết DNA từ nguồn khỏc nhau, - Bước 2: Chuẩn bị phương tiện vận chuyển gen,
- Bước 3: Chuẩn bị cỏc enzyme cắt và gắn DNA, để thiết kế vector DNA tỏi tổ hợp,
- Bước 4: Biến nạp DNA tỏi tổ hợp vào vật chủ,
- Bưúc 5: Theo dừi biểu hiện hoạt động của gen tỏi tổ hợp, - Bước 6: Phõn tớch cỏc sản phẩm của gen tỏi tổ hợp.
Trải qua hơn 30 năm phỏt triển, khỏi niệm về kỹ thuật di truyền được hiểu theo nghĩa rộng hơn, bao trựm hơn, nú bao gồm những thao tỏc khụng chỉ với từng gen riờng lẻ mà cả những phần lớn hơn của bộ gen và nhiều phương phỏp khỏc khuyếch đại gen (khụng qua tạo dũng invivo) như phương phỏp PCR. Dưới đõy chỳng tụi sẽ trỡnh bày cụng việc thực hiện của mỗi bước, tiến hành theo từng chương mà đầu tiờn là về enzyme.
CHƯƠNG IV
CÁC ENZYME SỬ DỤNG TRONG CễNG NGHỆ DI TRUYỀN
Sinh học phõn tử đó phỏt hiện và hiểu rừ cơ chế tỏc động của hàng loạt enzyme, nhờ đú đó sử dụng chỳng như những cụng cụ hữu hiệu trong việc cắt nối và ghộp cỏc gen.
Cỏc enzyme sử dụng trong cụng nghệ di truyền cú thể chia làm bốn nhúm lớn sau đõy:
- Cỏc enzyme giới hạn - Cỏc nuclease
- Cỏc enzyme kết nối - Cỏc enzyme tổng hợp
4.1- CÁC ENZYME GIỚI HẠN (RE-Rectriction Enzyme) 4.1.1- Hiện tượng giới hạn và hệ thống hạn chế - cải biờn 4.1.1.1- Hiện tượng giới hạn
Khi nghiờn cứu về sự xõm nhiễm của thực khuẩn thể (phage) vào tế bào vi khuẩn, người ta nhận thấy rằng trong một số trường hợp, thực khuẩn thể
khụng thể phỏt triển được trong tế bào vi khuẩn vỡ bộ mỏy di truyền của chỳng bị phỏ huỷ. Núi cỏch khỏc, cỏc vi khuẩn này khỏng thực khuẩn thể. Thớ nghiệm cú thể mụ tả như sau:
Cho phage xõm nhiễm hai chủng vi khuẩn A và vi khuẩn B, cỏc vi khuẩn này được nuụi cấy trong hai mụi trường thớch hợp. Sau khi thu hồi và phõn tớch DNA của phage, người ta nhận thấy:
- Ở chủng A: Xuất hiện nhiều DNA của phage cũn nguyờn vẹn nhưng tế
bào của vi khuẩn bị phỏ vỡ (do sự nhõn lờn của phage trong tế bào vi khuẩn). - Ở chủng B: Tế bào vi khuẩn khụng bị phỏ vỡ nhưng DNA phage bị cắt thành những đoạn cú kớch thước xỏc định. Trong trường hợp này, DNA của
phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiờu diệt khi vừa mới xõm nhập vào vi khuẩn.
Hiện tượng xảy ra ở vi khuẩn B gọi là hiện tượng giới hạn.
4.1.1.2- Enzyme giới hạn và hệ thống hạn chế - cải biờn (Restriction modification system)
Vào năm 1962, lần đầu tiờn Werner Arber đó chứng minh rằng: Cú những enzyme đặc biệt, hoạt động trong tế bào vi khuẩn, chỳng cú khả năng phõn biệt DNA của mỡnh và DNA lạ của phage. Cỏc enzyme này hạn chế khả
năng sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn bằng cỏch phõn hủy chỳng một cỏch đặc hiệu.
Vào năm 1970, Hamilton Smith phỏt hiện ở vi khuẩn Haemophilus influenzae Rd enzyme giới hạn và đặt tờn cho nú HindII.
Với những thớ nghiệm tiếp theo, Arber và cộng sự tại trường Đại học Geneva đó phỏt hiện ra nhiều chủng vi khuẩn cú khả năng phõn huỷ được DNA từ loài khỏc xõm nhập vào chỳng nhờ kết hợp của hai quỏ trỡnh enzyme.
Hai quỏ trỡnh enzyme được thống nhất trong một hệ thống gọi là hệ
thống hạn chế - cải biến, nhằm phõn hủy DNA lạ và bảo vệ DNA của mỡnh. - Sự hạn chế được thực hiện nhờ sự hoạt động của cỏc enzyme cắt hạn chế
(RE - Rectriction Enzyme). Đú chớnh là cỏc endodesoxyribonuclease đặc biệt cú thể nhận biết một trỡnh tự nucleotide đặc hiệu trong chuỗi DNA sợi đụi và cắt cả hai sợi DNA đú.
- Sự cải biến là sự thay đổi DNA của bản thõn tế bào theo con đường đặc biệt của mỗi loài, khiến DNA đú khỏc với DNA của loài khỏc và khụng phải là cơ chất của enzyme cắt hạn chế. Nhờ đú mà DNA của tế bào chủ được bảo vệ. Sự cải biờn được thực hiện nhờ cỏc enzyme metylase (mờtyl hoỏ) cú trong tế bào vi khuẩn. Enzyme này sẽ metyl hoỏ cytosine ở vị trớ (C5) và adenine (trờn N của C6) thuộc vựng giới hạn (chuỗi đớch).
Vớ dụ: Ở Enzyme Hind III, sau khi được metyl hoỏ (dấu chấm) ở
adeninee, chuỗi đớch này khụng được nhận biết bởi enzyme Hind III nữa, do
đú, DNA khụng bị cắt:
•AAGCTT TTCGAA • TTCGAA •
Vậy enzyme hạn chế và enzyme cải biờn cú cựng một đối tựơng nhận biết là chuỗi nucleotide đặc hiệu trong DNA ngoại lai và DNA của tế bào chủ, nhằm hạn chế sự sinh sản của DNA ngoại lai và bảo vệ DNA của mỡnh. Tuy nhiờn, cũng cú một số loại enzyme cú cả hai chức năng hạn chế và cải biờn.
Vớ dụ: Enzyme EcoRI với chuỗi đớch là:
5’----GAATTC---3’ 3’----CTTAAG---5’ 3’----CTTAAG---5’
4.1.2-Cỏch gọi tờn của enzyme giới hạn
Tờn gọi của enzyme giới hạn thường cú 3 hoặc 4 chữ xuất phỏt từ tờn của vi sinh vật mà từ đú, enzyme được xỏc định và chiết tỏch.
- Chữ cỏi đầu (viết hoa) là chữ đầu của tờn giống của vi khuẩn từ đú enzyme được trớch li.
- Chữ thứ 2 và thứ 3 (viết thường) là chữđầu tờn loài của vi sinh vật. - Đụi khi cú chữ thứ 4 chỉ chủng sinh vật.
- Chữ số la mó chỉ thứ tự RE được phỏt hiện (cú thể cú nhiều RE được phỏt hiện từ một chủng).
Vớ dụ như EcoRI - được xỏc định đầu tiờn ở E. Coli và EcoRV - là enzyme thứ 5 cũng đó được xỏc định ở E. Coli.
EcoRI: 5’----GAATTC----3’
3’----CTTAAG----5’
E: Giống Escherichia
co: Loài coli
R: Chủng Ry 13
I: Enzyme được tỏch lần đầu tiờn
Hpa I: 5’----GTTAAC----3’
3’----CAATTG----5’
H: Giống Haemophilus
pa: Loài parain fluenzae
I: Enzyme được tỏch lần đầu tiờn
Hind III: 5’----AAGCTT----3’
3’----TTCGAA----5’
H: Giống Haemophilus
in: Loài influenzae
d: Chủng Rd
III: Enzyme thứ ba được tỏch ra
BamHI: 5 ----GGATCC----3
3’----CCTAGG----5’
B: Giống Bacillus
am: Loài amyloliquefaciens
H: Chủng H
I: Enzyme thứ nhất được tỏch ra 4.1.3- Cỏc loại enzyme giới hạn
4.1.3.1- Loại I
Những enzyme giới hạn loại I cú trỡnh tự nhận biết đặc hiệu. Vị trớ cắt của cỏc enzyme loại này nằm ngoài trỡnh tự nhận biết một khoảng cỏch khụng nhất định, dao động từ 1.000 đến 5.000 nucleotide. Do khụng cú tớnh đặc hiệu trong cắt đoạn nờn sản phẩm của nú khụng đồng nhất và khụng phỏt hiện
được bằng điện di trờn gel.
Phõn tử lượng của chỳng vào khoảng 300.000D, cỏc bỏn đơn vị khụng giống nhau. Cần Mg+2 làm cofactor và ATP để cung cấp năng lượng cho enzyme này chuyển động dọc theo phõn tử DNA từ điểm nhận biết đến điểm cắt. Vớ dụ như EcoK do Meselson và Yuan tỏch được, cắt ở điểm cỏch trỡnh tự
nhận biết 1.000 nucleotide hoặc xa hơn nữa. 4.1.3.2- Loại II
Bao gồm những enzyme cú trỡnh tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu. Khi nhận biết được trỡnh tự đú, chỳng cắt ngay tại vị trớ nhận biết.
Phõn tử lượng thấp hơn loại I và ở khoảng từ 20.000 đến 100.000D. Chỉ cần Mg+2 làm cofactor và khụng cần năng lượng ATP. Do cú tớnh đặc hiệu về cắt đoạn DNA nờn sản phẩm thủy phõn là tập hợp những đoạn DNA
đặc hiệu và cho phộp phỏt hiện bằng điện di trờn gel agarose.
Ngày nay cú trờn 1.000 RE loại II đó được tỏch ra từ cỏc tế bào procaryote khỏc nhau và cú hơn 70 loại đang được thương mại húa trờn thị
trường.
4.1.3.3- Loại III
Bao gồm những enzyme sau khi nhận biết một trỡnh tự DNA đặc hiệu thỡ cắt ở vị trớ cỏch đú 20 nucleotide và tạo ra một số đầu cắt khỏc nhau. Tuy rằng vị trớ điểm cắt rất gần trỡnh tự nhận biết của chỳng nhưng khú đoỏn trước
được cỏc điểm cắt đú. Vỡ vậy mà RE loại III cũng như RE loại I khụng được sử dụng rộng rói trong cụng nghệ di truyền.
Trong 3 loại RE núi trờn chỉ cú RE loại II được ứng dụng nhiều hơn. 4.1.4- Cỏc loại RE trong nhúm II
4.1.4.1- Tớnh đặc hiệu vị trớ
1,- Trỡnh tự nhận biết của RE:
Cú thể núi cỏc RE này là những cụng cụ thực thụ để cắt cỏc DNA. Sự
cắt này xảy ra ở một vựng đặc biệt được nhận biết bởi enzyme. Mỗi một enzyme nhận biết một đoạn nucleotide khỏc nhau rất đặc hiệu đối với nú và
được gọi là trỡnh tự nhận biết (chuỗi đớch) hay đoạn đọc ngược xuụi.
Đặc trưng quan trọng nhất của cỏc trỡnh tự nhận biết là chỳng cú cấu trỳc
đối xứng nghịch đảo (palindromic), nghĩa là hai mạch của trỡnh tự hoàn toàn giống nhau khi chỳng được đọc theo chiều 5’ đến 3’ ở mỗi sợi đơn. Cỏc trỡnh tự nhận biết của enzyme giới hạn được cấu tạo từ 4 đến 6 đụi bazơ. Vớ dụ như đoạn DNA được đúng khung sau:
5’ - C C A G A A T T C A T - 3’ 3’ - G G T C T T A A G T A - 5’ 3’ - G G T C T T A A G T A - 5’
2,- Cỏc kiểu cắt của RE:
Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt trờn phõn tử DNA ngay chớnh giữa palindrom, tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng. Sau khi cắt, hai đầu khụng cú khả
năng tự kết hợp trở lại. Vớ dụ: HpaI 5' 3' G T T A A C C A A T T G 3' 5' G T T A A C C A A T T G Cắt đầu dớnh (đầu lệch): Cắt bờn này và bờn kia của tõm đối xứng để
tạo ra hai đầu lệch nhau một vài bazơ. Trong trường hợp này, cỏc đầu dớnh bổ
sung cú thể bị bắt cặp trở lại. Như vậy, khi cỏc DNA khỏc nguồn nhưng cựng cú chứa trỡnh tự nhận biết đặc hiệu của một RE, sau khi bị cắt sẽ cú cỏc đầu dớnh bổ sung giống nhau nờn cỏc đoạn DNA khỏc nguồn cú thể nối lại để tạo ra những phõn tử lai. Đõy là cơ sở của phương phỏp tạo dũng gen, một phương phỏp thỳc đẩy sự phỏt triển của cụng nghệ di truyền.
Vớ dụ: EcoRI G A A T T C C T T A A G A A T T G C T T A A G G 3,- Số lượng đoạn cắt:
Một RE cú khả năng thao tỏc trờn toàn bộ chiều dài của một phõn tử
DNA. Số lượng đoạn cắt phụ thuộc vào số chuỗi đớch của một RE cú trờn
phõn tử DNA mà nú thao tỏc. Sử dụng RE khỏc nhau, sẽ bị cắt khỏc nhau và tạo ra lượng đoạn cắt khỏc nhau.
Vớ dụ: EcoRI
G A A T T C C T T A A G