- gen điều hoà operator
G AATTC C T T A A
5.5.2- CÁC VECTOR CHUYỂN GEN LÀ PHAGE
Phage (thực khuẩn thể) là virus xõm nhiễm vi khuẩn làm phõn giải vi khuẩn. Việc sử dụng phage làm vector chuyển gen cú nhiều ưu điểm hơn so với vector là plasmid:
- Dễ xõm nhập vào vi khuẩn,
- Khả năng nhõn lờn nhanh trong tế bào chủ,
- Khả năng tiếp nhận đoạn DNA lạ lớn hơn plasmid.
Tuy nhiờn, việc sử dụng phage cú nhiều bất lợi như: - Thao tỏc ghộp DNA lạ phức tạp,
- DNA tỏi tổ hợp khụng tạo thành khuẩn lạc như DNA tỏi tổ hợp là plasmid, mà thành đĩa phõn giải xuất hiện trờn mặt thạch phủ đầy vi khuẩn
Phần lớn cỏc nhúm phage sử dụng làm vector đều bắt nguồn từ phage λ thuộc thế hệ thứ nhất.
5.5.2.1- Phage λ (thế hệ đầu)
Cấu tạo (Hỡnh 5-6) gồm hai phần: Phần đầu chứa DNA và được đúng gúi trong vỏ protein. Phần đuụi cho phộp virus cú thể tự cố định trờn cỏc tế
bào chủ là vi khuẩn:
- DNA của phage: Sợi đụi, mạch thẳng, dài 48,5kb gồm hàng chục gen.
Đầu tận cựng cuả DNA là sợi đơn gồm 12 nucleotide và chỳng được gọi là những đầu dớnh.
- Cũng như tất cả virus, DNA này được bao bọc trong vỏ protein.
Phage sinh sụi nẩy nở theo hai cỏch:
- Chu kỳ tan: phage được sinh sụi nẩy nở trong vi khuẩn. Cỏc phage mới
được tạo ra sẽđi ra khỏi vi khuẩn bằng cỏch làm tan vi khuẩn này.
DNA
Đ
uụi
Đầ
u
Hỡnh 5-6: Cấu tạo của phage λ
- Sinh tan: Là một kiểu sinh sản khỏc của virus, phage khụng làm tiờu tan vi khuẩn, thay vỡ tự sinh sản trong tế bào chất, phage sỏt nhập DNA của mỡnh với DNA của vi khuẩn.
5.5.2.2- Cỏc biến hỡnh của phage λ (phage thế hệ sau)
Cỏc phage thuộc thế hệ thứ hai rất đa dạng, mỗi một loại thớch ứng với một mục đớch sử dụng.
1,- Giảm một số vựng hạn chế giống nhau:
Phage λ tự nhiờn (chưa biến hỡnh) gọi là phage hoang dại cú chứa nhiều vựng hạn chế giống nhau như:
- 5 vựng EcoRI
- Nhiều vựng Hind III
Khụng thể cắt vector này bằng EcoRI hoặc HindIII đề cài vào đõy một mảnh DNA lạ. Người ta đó biến hỡnh loại phage λ này chỉ cũn chứa một vựng nhận biết của EcoRI tạo ra vector cài và hai vựng EcoRI tạo ra vector thay thế. Vớ dụ:
- λ NM607 là vector cài chứa đoạn cài DNA dài 9kb ở vị trớ cắt bởi EcoRI trong gen CI.
- λ charon 16: DNA được cài vào vị trớ EcoRI làm ức chế gen lacZ. - λ EMBL4 là một vector thay thế, đoạn DNA thay thế dài 23kb. 2,- Làm khuyết những phần khụng cần thiết: (Hỡnh 5-7)
Phage λ chỉ cú thể nhận được DNA lạ trong một chừng mực rất hạn chế. Khả năng của nú sẽ bị giảm rất nhiều khi độ dài genon (bộ gen) lớn hơn 105% (51 ữ 52kb) hoặc nhỏ hơn 78% (38 ữ 38,5kb) so với độ dài ban đầu.
Người ta tỡm cỏch tăng chiều dài của đoạn được cài bằng cỏch giảm đi nhiều hoặc ớt chiều dài những phần khụng cần thiết của genon của phage λ. Trong số cỏc vector bỏ 1/3 phần trung tõm giữa gen J và N. Trong khi đú giữ
lại đầu 5’ (tay trỏi) vốn mó hoỏ cho protein đầu, đuụi. Cũng như đầu 3’ (tay phải) vốn mó hoỏ cho protein thiết yếu cho sự tỏi bản và chu kỳ tan.
Tay phải DNA lạ
Tay trái
Các gen mã hoá protein tái bản, chu kỳ tan Các gen mã hoá
protein đầu đuôi
Phần trung tâm 5’ 3’ 5’ 3’ 0kb 48,5kb J 17kb N 35kb Hỡnh 5-7: Phage λ biến hỡnh
Phần trung tõm giữa gen J và N khụng cần thiết cho sự sinh sản của phage cú thểđược thay bằng DNA lạ. Cỏc đầu mảnh 5’ và 3’ đều là đầu dớnh.
3,- Cài một mảnh của operon lacZ:
Mục đớch là chọn ra phage tỏi tổ hợp mà đem lại khả năng phõn biệt bằng mắt cỏc phage λ đó được sỏt nhập một đoạn cài vào trong bộ gen của chỳng. Br Br Enzyme Cl 5 5 4 4 3 3 NH NH O O O HO HO OH OH OH OH OH -galactosidase β
X-Gal (không màu)
X(5 Brom-4 Clo- 3 Hydroxyindole) màu xanh Galactose Ch2 OH Ch2 OH
Hỡnh 5-8: Cơ chế phản ứng thủy phõn X-Gal bởi enzyme β-galactosidase
Bắt đầu từ phage λ người ta đó cấu tạo nờn (biến hỡnh) phage λgt11 đú là một vector biểu hiện. Phage này cú cài vào gen lacZ một DNA cần tạo
dũng. Cỏc phage gtλ11 tạo ra được cỏc vựng tan trắng nếu chỳng đó được cài DNA lạ vào gen lacZ (gen chịu trỏch nhiệm tổng hợp β-galactosidase).
Cỏc phage gtλ11 tạo ra vựng tan xanh nếu như chỳng khụng tiếp nhận
đoạn cài DNA lạ.
Để phỏt hiện cỏc phage λ tỏi tổ hợp, người ta cho vào mụi trường chứa phage λ tỏi tổ hợp (mụi trường nuụi cấy) một đường X-Gal (5brome-4chloro- indolyl-β-galactopyroside). Giống như đường lactose, nú bị thuỷ phõn bởi enzyme β-galactosidase. Người ta cú thể dễ dàng phỏt hiện khi cú mặt của enzyme β-galactosidase (Hỡnh 5-8).
5.5.2.3- Cỏc vector chuyển gen M13
Đặc tớnh cấu tạo: Là phage thể sợi, xõm nhiễm đặc trưng E. Coli. DNA của phage mạch đơn, cú kớch thước 6,4kb, trong đú cú khoảng 10 gen.
Ứng dụng: Do ưu điểm của loại vector này là tạo được một lượng lớn phần tử DNA chỉ mang trỡnh tự của một mạch, nờn chỳng thường được dựng xỏc định trỡnh tự nucleotide trong phương phỏp Sanger.
5.5.2.4- Cỏc biến hỡnh của phage M13
- Vector M13 mp2 là dạng đơn giản nhất, cú một hoặc hai trỡnh tự nhận biết bởi EcoRI nhận đoạn cài cú đầu dớnh được cắt bởi enzyme EcoRI.
- Vector M13 mp7 được tạo thành bằng cỏch đưa thờm vị trớ cắt hạn chế vào gen lacZ của vector M13 mp2. Vector này cú 4 điểm nhận biết bởi bốn enzyme cắt hạn chế: EcoRI, BamHI, SalI và PstI.