- gen điều hoà operator
G AATTC C T T A A
4.3- ENZYME KẾT NỐ
4.3.1- Ligase
Để kết nối hoặc hàn hai mảnh DNA hoặc RNA người ta phải sử dụng enzyme ligase trong sự cú mặt của ATP. Khi đú tạo ra một liờn kết ester giữa một mảnh chứa 5’ −phosphat và một mảnh chứa 3’−OH. Chỳng thường được sử dụng kết hợp với enzyme khỏc như kinase và alkaline phosphatase. Thụng thường, chắp hai mảnh đầu dớnh dễ hơn hai mảnh cú đầu phẳng.
4.3.1.1- Ecoli DNA ligase
Enzyme này được trớch ly từ E. Coli, chỉ cú thể xỳc tỏc nối hai mảnh DNA cú đầu so le. Ứng dụng tạo DNA tỏi tổ hợp trong kỹ thuật tỏch dũng. 4.3.1.2- T4 DNA ligase
Enzyme này được trớch từ phage T4. Cú khả năng xỳc tỏc nối hai trỡnh tự DNA đầu so le và đặc biệt là hai trỡnh tự đầu bằng. Khả năng gắn mạnh hơn 10 lần so với ligase tỏch từ E. Coli. Được ưa chuộng trong kỹ thuật tỏch dũng.
4.3.1.3- T4 RNA ligase
Enzyme này được trớch từ phage T4 , xõm nhiễm E. Coli. Cú khả năng xỳc tỏc nối hai trỡnh tự RNA bằng liờn kết phosphodiester. Cơ chất của nú thường là những phõn tử nhỏ nờn được dựng đỏnh dấu phúng xạ đầu 3’ của cỏc phõn tử RNA dựng làm mẫu dũ phõn tử.
4.3.2- Cỏc enzyme dephosphoryl hoỏ ( khử nhúm PO4-3 ) 1,- Alkaline phosphatase:
Được trớch ly từ E. Coli hay từ ruột bờ. Đặc tớnh của enzyme này là hoạt động ở pH kiềm và cú khả năng xỳc tỏc khử nhúm phosphate 5’ của một chuỗi DNA hoặc RNA và cỏc nucleotide tự do.
OHOH OH OH OH 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ OH OH OH OH 3’ 5’ 5’ 3’ Khe hở E kinase chuyển nhóm Po và hàn lại4 Khe hở Bazơ Nucleotide tự do đã khử nhóm PO4 3 Vectơ bị cắt bằng RE và sau khi khử nhóm PO bằng alkaline phosphatase 4 -3
Mảnh cài (DNA) ngoại lai bị cắt cùng RE với vector P P OH OH OH H H H CH2 OH OH O 5’
UUHỡnh 4-2: Phản ứng nối DNA ngoại lai với vector đó khử nhúm PO4-3
Alkaline phosphatase được ứng dụng để:
- Loại bỏ nhúm phosphate 5’ trờn trỡnh tự DNA hoặc RNA trước khi đỏnh dấu phúng xạ 5’ của chỳng bằng P32 làm mẫu dũ phõn tử lai.
- Loại bỏ nhúm phosphate 5’ trờn một vector vừa mới bị cắt bởi enzyme RE. Nhằm trỏnh vector này đúng kớn trở lại, khiến cho việc cài mảnh DNA
ngoại lai vào bị cản trở. Trong trường hợp này, sợi kộp được cài vào cú mang hai nhúm phosphat ở 5’ sẽ tạo ra hai trong bốn liờn kết este để hỡnh thành một DNA tỏi tổ hợp kộp vũng kớn cú chứa hai khe hở.
Sự chắp nối vector đó bị khử PO4-3 ở 5’ với DNA ngoại lai tạo ra DNA tỏi tổ hợp sợi kộp cú hai chỗ trống (OH) do OH 3’ của đoạn ngoại lai khụng tạo liờn kết ester với OH 5’ của vector đó khử nhúm PO4-3(Hỡnh 4-2).
4.3.3- Cỏc enzyme phosphoryl hoỏ
- Enzyme kinase (T4 polynucleotide kinase): được chiết từ trực khuẩn T4 xõm nhiễm E. Coli. Cú khả năng chuyển nhúm phosphate từ phõn tử ATP lờn
đầu 5’ của DNA hay RNA đó bị khử phosphate bởi enzyme alkaline phosphatase.
Enzyme kinase được ứng dụng để đỏnh dấu phúng xạ ở đầu 5’ của DNA làm mẫu dũ phõn tử trong kỹ thuật lai hoặc để chuyển nhúm PO4-3 tới cỏc trỡnh DNA khụng cú nhúm PO4-3 trong phương phỏp tạo dũng.