- gen điều hoà operator
G AATTC C T T A A
7.4- PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRèNH TỰ CỦA AXIT NUCLEIC
Khi nghiờn cứu về gen, việc xỏc định được vị trớ của gen trờn nhiễm sắc thể chưa cho phộp kết luận về bản chất của nú như gen đú tương ứng với gen gỡ, chức năng điều hũa hay mó húa cho protein nào. Nhờ việc giải trỡnh tự gen mà người ta đó giải quyết được những khú khăn trờn. Cú hai phương phỏp giải trỡnh gen đú là phương phỏp húa học của Maxam-Gilbert và phương phỏp enzyme của Sanger và cộng sự.
7.4.1- Phương phỏp húa học của Maxam-Gilbert
Vào năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiờn phỏt minh ra phương phỏp giải trỡnh tự gen bằng phương phỏp húa học. Nguyờn tắc của phương phỏp là dựa trờn phản ứng húa học thủy giải đặc hiệu, cỏc DNA khụng tự
xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phõn đoạn cú kớch thước khỏc nhau.
Trước hết, phõn tử DNA được đỏnh dấu đồng vị phúng xạ P32ở đầu 5’ của mạch đơn, tạo những đoạn đỏnh dấu cú thể phỏt hiện bằng hỡnh phúng xạ. Xử lớ húa học đặc hiệu phõn hủy đặc trưng một loại nucleotide của mạch DNA đó đỏnh dấu phúng xạ, tạo cỏc đoạn oligonucleotide cú chiều dài hơn kộm nhau 1 nucleotide được phỏt hiện bằng điện di. Kết qủa cỏc phản ứng húa học xử lớ mạch DNA được phỏt hiện bằng điện di trờn gel polyacriamid cú thể
xỏc định được trỡnh tự mạch đơn.
Mạch đơn đó đỏnh dấu phúng xạ cú thể xử lớ theo 4 nhúm phản ứng: - Nhúm phản ứng thứ nhất xử lớ mạch đơn DNA bằng dimethyl sulphat làm đứt mạch tại G.
- Nhúm phản ứng thứ hai xử lớ mạch đơn DNA bằng axit (pH=2) gõy đứt mạch đơn tại A hoặc G.
- Nhúm phản ứng thứ ba xử lớ mạch đơn DNA bằng hydrazin gõy đứt mạch đơn tại T và C.
- Nhúm phản ứng thứ 4 xử lớ mạch đơn DNA bằng hydrazin với nồng độ
muối cao làm đứt mạch đơn tại C.
Kết quả: Cỏc phản ứng tạo thành cỏc đoạn DNA cắt ngẫu nhiờn, cú kớch thước khỏc nhau. Điện di trờn gel polyacriamid (Hỡnh 7-5), đọc kết quả điện di bằng mỏy phúng xạ tự ghi ta thu được trỡnh tự nucleotide của mạch
đơn DNA. G C ACACTG ACACT ACAC ACA AC A T+C G+A - +
Hỡnh 7-5: Sơ đồ giải trỡnh gel theo phương phỏp hoỏ học
Vớ dụ, đoạn mạch đơn DNA đỏnh dấu phúng xạ P32, đầu 5` ở
nucleotide A cú trỡnh tự : 5`−P32ACACTG
Sau khi xử lớ bằng phương phỏp húa học và cắt mạch đơn núi trờn ta thu được cỏc phõn đoạn sau:
- Kết quả nhúm 1 cắt tại G: P32ACACT P32ACACTG - Kết quả phản ứng nhúm 2 cắt tại A hoặc G: P32AC P32ACACTG P32ACACT P32ACACTG - Kết quả phản ứng nhúm 3 cắt tại C hoặc T: P32A P32ACA P32ACACTG P32ACAC P32ACACTG - 171 -
- Kết quả phản ứng nhúm 4 cắt tại C: P32A P32ACA P32ACACTG
Tổng hợp cỏc kết quả, ta thu được trỡnh tự cỏc nucleotide trờn mạch
đơn DNA, từđú ta biết được trỡnh tự sắp xếp cỏc nucleotide của gen. 7.4.2- Phương phỏp enzyme sử dụng cỏc dideoxynucleotide
Phương phỏp này được F. Sanger và cộng sự phỏt minh vào năm 1977. Nguyờn tắc của phương phỏp dideoxy là dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trỡnh tự cần xỏc định nhờ hoạt động của enzyme DNA-polymerase. Với việc sử dụng thờm cỏc dideoxynucleotide (ddNTP) với cỏc deoxynucleotide (dNTP) thụng thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hỡnh thành một tập hợp nhiều đoạn DNA cú kớch thước khỏc nhau. Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi mạch đơn khoảng 20 nucleotide, bốn loại dNTP (trong đú cú một loại đỏnh dấu bằng đồng vị phúng xạ) và bổ xung thờm 1% ddATP (hoặc ddCTP, ddGTP, ddTTP) cho mỗi loại phản ứng. Cỏc ddNTP mất hai nguyờn tử oxy ở C3 và C2 khi mạch đơn DNA đang tổng hợp được gắn 1 ddNTP phản ứng ngừng tổng hợp. Mỗi loại phản ứng được thực hiện riờng rẽ, cú DNA khuụn, DNA mồi, đầy đủ cỏc loại dNTP, enzyme Taq DNA- polymerase, dung dịch đệm và cú thờm khoảng 1% một loại ddNTP. Kết quả
phản ứng tổng hợp nờn cỏc đoạn oligonucleotide dài ngắn khỏc nhau một nucleotide và được nhận biết nhờ phương phỏp điện di (Hỡnh 7-6). Tổng hợp kờt quả phản ứng ở 4 ống, thu được trỡnh tự cỏc nucleotide của mạch đơn, cú thể biết được trỡnh tự sắp xếp cỏc nucleotide trong gen.
TTG TG TGA TGAG TGAGG TGAGGT TGAGGTC - +
Hỡnh 7-6: Sơ đồ giải trỡnh gen theo phương phỏp Sanger
Vớ dụ: Giải trỡnh đoạn gen: 5`- AGTCCAG-3` - Mạch cần tổng hợp là 3`- TCAGGTC-5` - Kết quả phản ứng theo loại A: TCAdd TCAGGTC - Kết quả phản ứng loại G: TCAGdd TCAGGdd TCAGGTC - Kết quả phản ứng loại C: TCdd TCAGGTCdd TCAGGTC - Kết quả phản ứng loại T: Tdd TCAGGTdd TCAGGTC
7.4.3- Phương phỏp xỏc định trỡnh tự nucleotide bằng mỏy tự động
Trong kĩ thuật này, người ta khụng đỏnh dấu bằng cỏc đồng vị phúng xạ mà bằng húa chất (cỏc fluochrome). Mỗi loại ddNTP được đỏnh dấu bằng một fluochrome cú màu khỏc nhau. Như vậy, tất cả cỏc oligonucleotide cựng chấm dứt tại một loại ddNTP sẽ cú cựng một màu. Sau khi điện di trờn gel polyacriamid, kết quả sẽđược xử lớ qua một hệ thống vi tớnh.