- gen điều hoà operator
G AATTC C T T A A
7.3- CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ
7.3.1- Phương phỏp Southern blot
Phương phỏp Southern blot được E. Southern phỏt minh vào năm 1975, cho phộp nghiờn cứu DNA của bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển gen hoặc kiểm tra sự cú mặt của một gen nào đú trong bộ gen của tế bào. Để thực hiện
được quỏ trỡnh lai, đầu tiờn, người ta phải tỏch DNA bộ gen của tế bào. Sử
dụng enzyme cắt giới hạn để cắt phõn tử DNA thành những đoạn nhỏ, điện di trờn gel agarose để tỏch những đoạn cú kớch thước khỏc nhau. Gõy biến tớnh DNA trờn gel bằng dung dịch NaOH-0,5M, sau đú, chuyển DNA từ gel sang màng lai (nitrocellulose). Trong quỏ trỡnh chuyển, vị trớ của DNA phải được giữ nguyờn.
DNA cố định trờn màng được lai với mẫu dũ cú đỏnh dấu phúng xạ, ở
nhiệt độ 65°C và thời gian lai khoảng 3ữ8 giờ. Sau quỏ trỡnh lai người ta rửa màng lai để loại bỏ những mẫu dũ khụng bắt cặp chuyờn biệt với DNA cố định trờn màng lai. 4 1 2 3 6 5 7 8 2: Gía đỡ 3: Bấc giấy lọc 4: Gel agarose 8: Vật nặng 7: Tấm kính 6: Giấy thấm 5: Màng lai 1: Dung dịch đệm 20X.SSC
Hỡnh 7-4: Kỹ thuật chuyển DNA từ gel agarose lờn màng lai
Cuối cựng, người ta dựng kĩ thuật phúng xạ tự ghi để định vị cỏc phõn tử lai. Trong kĩ thuật này, người ta đặt một phim nhạy cảm với tia xạ ỏp sỏt vào màng lai. Cỏc phõn tử lai cú đỏnh dấu phúng xạ sẽ tỏc động lờn phim và kết quảđược thể hiện qua cỏc chấm đen trờn phim (Hỡnh 7-4).
Cỏc ứng dụng quan trọng của Sourthern blot: - Lập bản đồ giới hạn của một gen.
- Phỏt hiện cỏc đa dạng trỡnh tự của cựng một gen ở cỏc chủng hay cỏc cỏ thể khỏc nhau qua sự so sỏnh bản đồ giới hạn của chỳng.
- Phỏt hiện cỏc đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tỏi tổ hợp trờn một gen vỡ chỳng làm thay đổi bản đồ giới hạn.
7.3.2- Phương phỏp Northern blot
Phương phỏp lai Northern blot là phương phỏp lai RNA của tế bào với mẫu dũ DNA. Phương phỏp này được sử dụng để xỏc định kớch thước và hàm lượng của một mRNA đặc trưng trong một hỗn hợp RNA. Về nguyờn tắc giống như lai Southern blot, được tiến hành như sau:
RNA (đó được làm biến tớnh) sẽ được phõn tớch theo kớch thước nhờ điện di trờn gel agarose cú chứa chất làm biến tớnh. Cỏc chất làm biến tớnh cú tỏc dụng ngăn cản sự hỡnh thành cấu trỳc bậc hai của RNA sau khi đó biến tớnh. Và do đú, khụng cản trở sự di chuyển cũng như sự tỏch của cỏc RNA trờn gel. Sau đú, RNA được chuyển lờn màng lai. Những RNA cố định trờn màng lai được đem lai với mẫu dũ DNA cú đỏnh dấu phúng xạ để tạo phõn tử
lai RNA-DNA. Cỏc phõn tử lai được phỏt hiện nhờ kĩ thuật phúng xạ tự ghi. 7.3.3- Lai tại chỗ
Lai tại chỗ là phương phỏp lai phõn tử, trong đú, trỡnh tự axit nucleic cần tỡm nằm ngay trong tế bào hay trong mụ. Lai tại chỗ cho phộp nghiờn cứu axit nucleic mà khụng cần qua giai đoạn tỏch chiết chỳng ra khỏi mụ, tế bào. Cỏc ứng dụng của kiểu lai này rất đa dạng đi từ kĩ thuật định vị gen trờn nhiễm sắc thể, phỏt hiện dũng vi khuẩn tỏi tổ hợp trong phương phỏp tạo dũng
đến việc nghiờn cứu một mRNA chuyờn biệt trong tế bào và mụ. Phương phỏp này ớt tốn kộm hơn là lai Southern blot, mẫu dũ được đỏnh dấu bằng huỳnh quang thay cho mẫu dũ đỏnh dấu phúng xạ. Tựy từng loại tế bào và mụ cú thể thực hiện cỏc phương phỏp lai tại chỗ khỏc nhau.
7.3.3.1- Lai trờn khuẩn lạc
Phương phỏp này được sử dụng để phỏt hiện dũng vi khuẩn cú mang vector tỏi tổ hợp cần tỡm trong một ngõn hàng gen. Ngõn hàng gen được trải trờn mặt thạch của hộp petri. Sau khi cỏc khuẩn lạc đạt kớch thước nhất định, người ta thu lấy dấu ấn của chỳng bằng cỏch ỏp một màng lai trờn mặt thạch. Mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trờn màng lai. Sau đú xử lớ màng lai bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn và làm biến tớnh DNA. Kết quả
phúng xạ tự ghi của dấu ấn cho phộp xỏc định dũng vi khuẩn cần tỡm trờn hộp pectri ban đầu. Dũng này sẽđược thu nhận và phõn tớch.
7.3.3.2- Lai trờn nhiễm sắc thể
Phương phỏp này cung cấp thụng tin chớnh xỏc về vị trớ và sự phõn bố
của một trỡnh tự DNA cần tỡm trờn nhiễm sắc thể nhờ một mẫu dũ chuyờn biệt. Chọn tế bào kỡ giũa của quỏ trỡnh phõn bào khi cỏc nhiễm sắc thể cú kớch thước lớn nhất (cỏc nhiễm sắc thể này thường cú nguồn gốc từ bạch cầu). Bằng cỏc kĩ thuật xử lớ cố định tế bào trờn lam kớnh, định vị hỡnh dạng và vị
trớ của nhiễm sắc thể. Sử dụng enzyme RNase và enzyme protease K để loại - 168 -
bỏ RNA và protein. Nhiễm sắc thể cố định trờn lam được đem lai với mẫu dũ DNA hoặc RNA cú đỏnh dấu phúng xạ. Sử dụng kĩ thuật phúng xạ tự ghi để
phỏt hiện phõn tử lai (phõn tử lai trờn lam được phủ một huyền dịch nhạy cảm với tia xạ). Sau một thời gian, cho tia xạ tỏc động lờn huyền dịch, lam được
đem quan sỏt dưới kớnh hiển vi. Tại cỏc điểm cú cỏc phõn tử lai xuất hiện cỏc chấm đen trờn lớp huyền dịch.
7.3.3.3- Lai trờn tế bào và mụ
Lai trờn tế bào và mụ thường được sử dụng để phỏt hiện cỏc mRNA. Cỏc loại mRNA hoạt động ở cỏc giai đoạn khỏc nhau trong quỏ trỡnh phỏt triển tế bào và cơ thể. Lai trờn tế bào và mụ nhằm nghiờn cứu giai đoạn hoạt
động của mRNA, từ đú, tỡm hiểu hoạt động của một gen, mối liờn quan giữa phiờn mó và giải mó, định vị cỏc gen cần nghiờn cứu trờn nhiễm sắc thể.
Mụ hoặc tế bào đưọc xử lớ bằng phương phỏp mụ, tế bào học như: cố định, khử nước, tẩm paraffin, cắt thành những lỏt mỏng (7ữ10àm) trải trờn lam. Xử lớ với enzyme protease để loại bỏ protein, sau đú xử lớ với enzyme DNase để loại bỏ DNA. Lai với mẫu dũ cú đỏnh dấu phúng xạ hoặc huỳnh quang. Sau đú phủ một lớp huyền dịch nhạy với phúng xạ hoặc huỳnh quang
để một thời gian thớch hợp cho phản ứng xảy ra, quan sỏt kết quả lai dưới kớnh hiển vi. Trong tế bào những vị trớ cú phõn tử lai được phỏt hiện bằng cỏc chấm đen.
Phạm vi sử dụng của phương phỏp:
- Đối tượng nghiờn cứu cú tổ chức phức tạp bao gồm nhiều tập hợp cỏc tế
bào khỏc nhau như bộ nóo.
- Cỏc phương phỏp miễn dịch tế bào cho phộp phỏt hiện một protein chuyờn biệt thụng qua khỏng thể đặc trưng của nú. Khi phối hợp những phương phỏp miễn dịch tế bào và lai tại chỗ, người ta sẽ phỏt hiện đồng thời mRNA và protein của nú, từ đú, xỏc định được mối tương quan giữa hoạt
động phiờn mó và dịch mó của một gen.
- Bằng cỏch lai nhiều lỏt cắt liờn tục (cú cấu trỳc gần như đồng nhất) với nhiều mẫu dũ khỏc nhau, người ta cú thể xỏc định vị trớ, sự phõn bố và tương tỏc giữa cỏc mRNA cựng tham gia vào một quỏ trỡnh sống.