1,- Nhận biết điểm khởi sự và thỏo xoắn DNA:
Quỏ trỡnh sao mó được nghiờn cứu khỏ kỹ ở tế bào vi khuẩn E. Coli. Sự
sao mó bắt đầu khi protein B đặc hiệu nhận biết điểm khởi sự sao mó (replication origine) và gắn vào trỡnh tự đặc hiệu đú. Tiếp theo, enzyme topoisomerase thực hiện thỏo xoắn phõn tử DNA từ điểm khởi sự.
Enzyme helicase sử dụng năng lượng ATP cắt đứt cỏc liờn kết hydro giữa cỏc bazơ bắt cặp của hai mạch phõn tử, tỏch hai mạch để tạo thành chạc ba hỡnh chữ Y, gọi là chạc ba sao mó (replication fork). Cú nhiều loại enzyme helicase: cú loại gắn trờn mạch, di chuyển và cắt liờn kết hydro theo chiều từ đầu 3' đến đầu 5'; cú loại gắn lờn mạch, di chuyển và cắt liờn kết hydro theo chiều 5' → 3'. Sau khi tỏch rời, hai mạch đơn sẽ được protein làm căng mạch SSB giữ khụng cho chập lại, làm cho trạng thỏi mở xoắn được bền vững. Mỗi phõn tử protein SSB bỏm vào 8 nucleotide trờn mạch đơn, mỗi chạc ba sao mó cú khoảng 250 phõn tử protein SSB hoạt động. Mạch khuụn được sử dụng
đến đõu, cỏc phõn tử protein SSB sẽ được giải phúng đến đú. 2,- Tổng hợp mồi:
Enzyme DNA-polymerase chỉ cú khả năng tổng hợp sợi DNA mới bằng cỏch nối dài đầu 3'−OH tự do của một đoạn mồi đó bắt cặp sẵn trờn khuụn theo chiều 3'−OH đến đầu 5'−P. Mồi là một đoạn RNA nhỏ chừng 10 nucleotide, được tổng hợp từ khuụn của sợi DNA. Phức hợp enzyme primase- RNA-polymerase bỏm vào mạch đơn của chạc sao mó tổng hợp đoạn RNA mồi tạo đầu 3'−OH tự do của đoạn mồi. Enzyme DNA-polymerase III xỳc tỏc tổng hợp mạch bổ sung từ đầu 3'−OH tự do của mồi, kộo dài mạch. Sự tổng hợp cỏc mạch đơn DNA mới, vỡ vậy, chỉ đi theo một chiều xỏc định từ đầu 5'
đến đầu 3' (5'→3').
3,- Sự tổng hợp mạch DNA mới xảy ra một cỏch liờn tục trờn mạch khuụn cú chiều 3'→ 5' và giỏn đoạn trờn mạch khuụn cú chiều 5'→ 3':
Trờn mạch khuụn cú chiều 3'→5', mạch mới được tổng hợp theo chiều 5'→3' một cỏch liờn tục, cựng hướng thỏo xoắn của phõn tử DNA. Đoạn mồi sẽ được tổng hợp từ điểm khởi sự sao mó. Khi xuất hiện đầu 3'−OH tự do của
đoạn mồi thỡ enzyme DNA-polymerase III gắn vào và tổng hợp ngay mạch bổ
sung theo chiều 5'→3' một cỏch liờn tục cho đến điểm kết thỳc sao mó. Mạch này được tổng hợp nhanh hơn nờn người ta thường gọi là mạch nhanh (leading strand). Như vậy, để tổng hợp được sợi DNA mới bổ sung cho sợi làm khuụn này, enzyme DNA-polymerase chỉ cần cú một đoạn mồi (Hỡnh 2- 4). 5’ 5’ 3’ 3 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ ’ M ạ ch chậm Chạc ba sao mã H−ớng sao mã
Hỡnh 2-4: Sơ đồ biểu diễn cỏch sao chộp giỏn đoạn và liờn tục trờn 2 sợi DNA khuụn
Trờn mạch khuụn cú chiều từ đầu 5'→3', việc tổng hợp mạch mới phức tạp hơn, do qui luật tổng hợp sợi DNA mới bổ sung luụn thực hiện theo chiều từ đầu 5'→3'. Mạch mới bổ sung cho mạch khuụn này được tổng hợp dưới dạng từng đoạn ngắn gọi là okazaki. Mỗi một okazaki cú một đoạn mồi. Ở vi khuẩn, độ dài một okazaki khoảng 1.000 đến 2.000 nucleotide, cũn ở tế bào eucaryote, số lượng nucleotide trong một okazaki ngắn hơn so với ở vi khuẩn. Hướng di chuyển để tổng hợp sợi mới của DNA-polymerase III ngược với hướng thỏo xoắn của phõn tử DNA mẹ.
Sợi con thứ hai này được tổng hợp một cỏch chậm hơn nờn thường gọi là mạch chậm hay mạch sau (lagging strand). Cỏc đoạn RNA mồi sau đú sẽ bị
enzyme ribonuclease phõn huỷ. Cỏc lỗ trống xuất hiện sau khi cỏc đoạn mồi mất đi sẽ được lấp đầy nhờ hoạt động của enzyme DNA-polymerase I. Cuối cựng, enzyme DNA-lygase nối cỏc liờn kết phosphodiester giữa cỏc đoạn, tạo nờn mạch DNA con hoàn chỉnh.
Ngoài chức năng tổng hợp sợi DNA mới theo chiều từ đầu 5'→3', enzyme DNA-polymerase III cũn cú khả năng sửa sai nhờ hoạt tớnh exonuclease. Trờn đường di chuyển để tổng hợp, nếu nú gặp chỗ mà
nucleotide mới bắt cặp sai, nú sẽ lựi lại cắt bỏ nucleotide sai và lắp nucleotide
đỳng vào.
Kết quả, sau quỏ trỡnh sao mó, hai phõn tử DNA con được hỡnh thành cú cấu tạo giống y như phõn tử DNA mẹ ban đầu, đảm bảo thụng tin di truyền
được truyền từ thế hệ này qua thế hệ khỏc một cỏch chớnh xỏc. 2.2.3- Sao mó DNA sợi kộp dạng vũng của tế bào procaryote 2.2.3.1- Sao mó theo kiểu hỡnh mắt
H−ớng tháo xoắn H−ớng tháo xoắn
Điểm khởi sự sao mã H−ớng sao mã Sao mã thực hiện theo 1 h−ớng Sao mã thực hiện theo cả 2 h−ớng
Hỡnh 2-5: Sơ đồ tổng hợp DNA dạng vũng ở vi khuẩn
DNA của tế bào procaryote thường cú dạng xoắn kộp hỡnh trũn. Quỏ trỡnh tổng hợp cũng được thực hiện từ một điểm khởi đầu (replication origine) gọi là điểm xuất phỏt và triển khai ra cả hai phớa chạc ba sao mó và lan dần về
hai phớa, cuối cựng tạo ra hai phõn tử DNA lai. Cú trường hợp sự tổng hợp chỉ
xảy ra về một phớa của điểm khởi đầu. Khi DNA dạng vũng trũn đang sao chộp, quan sỏt thấy cú dạng hỡnh con mắt (eye replication).
Một đơn vị sao mó thống nhất (từ một điểm xuất phỏt) gọi là replicon. Bộ gen của cỏc sinh vật procaryote chỉ cú một replicon. Tốc độ tổng hợp DNA của E. Coli cú thể đạt 50.000 nucleotide/phỳt, chu kỳ sao mó kộo dài khoảng 20 phỳt (Hỡnh 2-5).
2.2.3.2- Sao mó kiểu hỡnh trũn xoay 3’ 5’ Cắt liên kết phosphodiester Sợi mới đ−ợc tổng hợp từ đầu 3 5 một cách liên tục ’ ’ 3’ 5’ SSB
Sợi khuôn có chiều 5 3 đ−ợc tổng hợp một cách gián đoạn ’ ’ Đoạn mồi Replisome Okazaki sau Okazaki tr−ớc
Hỡnh 2-6: Sao mó theo kiểu hỡnh trũn xoay
Ngoài kiểu sao mó cú dạng hỡnh con mắt như trờn, ở một số vi khuẩn và virus cũn cú kiểu tổng hợp khỏc gọi là sao mó hỡnh trũn xoay. Quỏ trỡnh tổng hợp bắt đầu bằng sự cắt liờn kết phosphodiester tại một điểm xỏc định trờn một sợi DNA trũn kộp tạo ra hai đầu mỳt, một đầu kết thỳc bằng nhúm
3'−OH và đầu kia là đầu 5'−phosphat. Sự tổng hợp một mạch mới một cỏch - 49 -
liờn tục bằng cỏch kộo dài mạch từ đầu 3'−OH đồng thời dịch chuyển theo dạng xoay trũn, đầu 5'−P được xoay ra ngoài và một mạch mới khỏc được tổng hợp giỏn đoạn theo okazaki, sau khi kết thỳc, hai phõn tử DNA con được hỡnh thành (Hỡnh 2-6).
2.2.4-Sao mó ở tế bào eucaryote
Ở tế bào eucaryote cú nhiều nhiễm sắc thể, đa dạng, mỗi nhiễm sắc thể
là một phõn tử DNA nằm liờn kết với protein, nờn quỏ trỡnh sao mó phức tạp. Nhiều điểm sao mó xảy ra đồng thời, hay núi cỏch khỏc là trong cựng một thời điểm cú nhiều đơn vị sao mó (replicon). Vớ dụ như ở nấm men bỏnh mỳ
S. Cerevisiae cú 500 replicon. 5 5 ’ ’ 3 3 ’ ’
Quỏ trỡnh tổng hợp DNA ở tế bào eucaryote phức tạp hơn và tốc độ
chậm hơn (3.000 nucleotide/phỳt).
Đặc điểm quan trọng trong quỏ trỡnh sao mó ở tế bào eucaryote là cú nhiều đơn vị sao mó xảy ra, đồng thời, trờn một phõn tử DNA và tế bào cú cơ
chế kiểm soỏt nghiờm ngặt quỏ trỡnh này. Điểm nào đó sao qua một lần rồi thỡ khụng lặp lại trước khi toàn bộ phõn tử DNA được tỏi tạo hoàn toàn.
Sau khi sao mó, cỏc DNA con cú cấu tạo giống y như DNA mẹ ban đầu
được phõn chia đều đặn về mỗi tế bào con trong quỏ trỡnh phõn bào. 2.2.5-Sửa sai DNA trong tế bào
2.2.4.1- Sửa sai trong sao mó
Sửa chữa những sai sút trờn DNA nhằm khụi phục lại cấu trỳc ban đầu là một đặc tớnh của mọi tế bào sống. Trong quỏ trỡnh sao mó, cỏc bazơ nittơ
cũng cú thể bắt cặp sai. Sự bắt cặp sai thường xảy ra là A bắt cặp sai với C (A...C) và G bắt cặp sai với T (G...T). Sở dĩ cú sự bắt cặp sai như vậy là do trạng thỏi tồn tại của cỏc bazơ cú những thay đổi, dẫn đến sự nhận biết sai.
Nhờ cơ chế tổng hợp DNA luụn luụn khởi động từ đầu 5’→ 3’, nờn việc sao mó được kiểm soỏt và sửa chữa một cỏch chớnh xỏc. Cỏc enzyme DNA-polymerase I và III vừa làm chức năng polymer húa vừa cú hoạt tớnh exonuclease theo hướng 5’→ 3’ và 3’→ 5’. Nếu trờn đường di chuyển bắt gặp một nucleotide lắp sai, chỳng sẽ lựi lại để cắt bỏ và lắp nucleotide đỳng vào. Khi hệ thống kiểm tra phỏt hiện cú sai sút, cỏc enzyme endonuclease sẽ
cắt bỏ đoạn sai, sau đú, enzyme DNA-polymerase I sẽ tổng hợp lại cho đỳng và enzyme DNA-ligase sẽ nối lại để phục hồi trạng thỏi bỡnh thường. Khi tổng hợp nhõn tạo phõn tử DNA (invitro) người ta ước tớnh sai sút là 10−5 , nghĩa là, trong 105 nucleotide được tổng hợp thỡ cú 1 nucleotide sai. Vớ dụ DNA trong tế bào E. Coli cú 3x106 nucleotide, như vậy cứ sau mỗi lần sao mó thỡ cú 30 nucleotide sai, hay cỏc nhiễm sắc thể ở người cú 3x109 nucleotide, như
vậy cứ sau mỗi lần sao mó thỡ cú 30.000 nucleotide sai. Nếu với tần xuất sai này thỡ số lượng đột biến sẽ rất lớn. Qua thực tế nghiờn cứu cho thấy tần xuất
đột biến trong cỏc quần thể sinh vật là nhỏ hơn rất nhiều.
Bằng cỏch đỏnh giỏ tần số đột biến xuất hiện trong cỏc quần thể, người ta ước tớnh sự sai sút trong sao mó nằm trong khoảng 10−9. Tuy nhiờn, trong thực tế, tỉ lệ sai sút cũn thấp hơn nhiều, vào khoảng 10−10đến 10−11, điều này chứng tỏ sự tồn tại một hệ thống kiểm tra và sửa sai rất hiệu quả của tế bào. 2.2.4.2-Sửa sai sau khi sao mó
Mụi trường sống và cơ thể sống cú mối quan hệ mật thiết với nhau. Cỏc biến động của mụi trường sống luụn tỏc động đến cỏc sinh vật. Những thay
đổi của mụi trường bờn ngoài cú tỏc động trực tiếp đến bộ mỏy di truyền, làm biến đổi nú.
1,- Cỏc tỏc nhõn cú thể làm thương tổn DNA trong quỏ trỡnh tồn tại:
- Cỏc tia vũ trụ và cỏc tia phúng xạ cú năng lượng cao cú thể làm biến đổi cỏc bazơ nitơ như gắn thờm cỏc nhúm chức khỏc vào mạch vũng hay làm đứt vũng, làm đứt cỏc liờn kết hydro giữa hai mạch hay làm cắt mạch của DNA,...
- Cỏc tia cực tớm trong ỏnh sỏng mặt trời thường gõy nờn sự dimer húa cỏc bazơ thymine, hỡnh thành liờn kết giữa hai bazơ thymine nằm kề nhau, làm chỳng mất khả năng liờn kết với bazơ adenine của mạch bổ sung.
- Tỏc động của cỏc thành phần trong nội bào.
Sự tổn thương phõn tử DNA cú thể gõy ra do quỏ trỡnh trao đổi chất bất bỡnh thường gõy ra cỏc chất độc hại và cỏc gốc tự do bất lợi, hay do hoạt động của cỏc enzyme khụng đồng bộ làm tồn đọng những sản phẩm trung gian bất lợi.
Ngoài ra, cũn cú nhiều tỏc nhõn húa học khỏc của mụi trường bờn ngoài cũng gõy nờn sự biến đổi cú thể xảy ra trờn DNA.
2,- Một số khả năng gõy biến đổi trờn phõn tử DNA:
- Góy mạch hay đứt mạch: Do sợi DNA rất mảnh, bản thõn nú lại xoắn cuộn nhiều lần nờn rất dễ bị góy hay đứt mạch do tỏc động bờn ngoài hay khi thỏo xoắn.
- Mất cỏc bazơ bổ sung, nghĩa là làm cho bazơ tương ứng khụng cú cặp (như mất bazơ purine).
- Biến bazơ nitơ này thành bazơ khỏc, gõy nờn sự bắt cặp sai, như: Khi mất nhúm amin, cytosine sẽ biến nú thành uracil hoặc 5-metyl-cytosine-desamin bị nhận nhầm là thymine.
- Cỏc bazơ nitơ cú thể tồn tại dưới 2 dạng ceton và enol nờn dẫn dến bắt cặp sai.
- Gắn thờm nhúm −CH3 , −C2H5: Khi gắn thờm nhúm ankyl sẽ làm thay đổi tớnh chất của cỏc bazơ nitơ dẫn đến bắt cặp sai.
3,- Cơ chế phũng ngừa và sửa sai:
Để bảo vệ và thớch nghi với những biến đổi, tế bào cú cơ chế phũng ngừa và sửa sai. Cỏc cơ chế phũng ngừa của tế bào như hệ thống enzyme khử độc, loại bỏ cỏc độc tố, hệ thống điều hoà cõn bằng cần thiết cho tế bào, hệ
thống enzyme tham gia sửa sai. Vớ dụ sau cho thấy hệ thống sửa sai và phũng ngừa của tế bào:
- Enzyme Superoxide Dismutase (SOD) làm nhiệm vụ giảm độc: Enzyme SOD được phỏt hiện năm 1968, cú mó số EC.1.15.1.1 , cú mặt trong tất cả cỏc tế bào cú chuyển húa oxy. Chỳng xỳc tỏc phản ứng phõn huỷ gốc superoxyt O2−trong tế bào theo sơđồ phản ứng sau: