- gen điều hoà operator
G AATTC C T T A A
4.4- CÁC ENZYME TỔNG HỢP
Enzyme sao chộp một axit nucleic: Quỏ trỡnh sao chộp chuỗi axit nucleic tức là tổng hợp một chuỗi DNA hoặc RNA được tiến hành theo nguyờn tắc bổ sung và đối song song. Việc thờm một nucleotide mới được tiến hành theo hướng 5’ → 3’.
4.4.1- Enzyme sao chộp DNA → DNA
Là cỏc enzyme DNA-polymerase I, enzyme T4 DNA-polymerase, Taq polymerase tổng hợp chuỗi DNA từ một khuụn DNA hay cũn gọi "enzyme phụ thuộc DNA".
4.4.1.1- Enzyme DNA - polymerase I
Enzyme DNA-polymerase cú nguồi gốc được tỏch từ vi khuẩn E. Coli, chỳng cú ba hoạt tớnh:
- Hoạt tớnh tổng hợp DNA theo hướng 5’ → 3’ và sửa chữa trong sao chộp, - Hoạt tớnh exonuclease theo hướng 3’ → 5’,
- Hoạt tớnh exonuclease theo hướng 5’ → 3’.
Ngày nay enzyme DNA-polymerase được dựng chủ yếu để xỏc định trỡnh tự DNA bằng phương phỏp didesoxynucleotide của Sanger, ngoài ra, cũn dựng để tổng hợp mẫu dũ cú độ phúng xạ cao, hoặc xõy dựng cỏc vector từ DNA mạch đơn.
Trong thực tế người ta hay sử dụng đoạn Klenow là sản phẩm thủy phõn của enzyme DNA-polymerase I, cú hoạt tớnh exonuclease theo hướng 3’ → 5’ và hoạt tớnh tổng hợp.
4.4.1.2- Enzyme T4 DNA - polymerase
Cú nguồn gốc từ phage T4 xõm nhiễm E. Coli cú hoạt tớnh exonuclease theo hướng 3’ → 5’ . Enzyme này mạnh nờn được sử dụng nhiều để tổng hợp mẫu dũ cú độ phúng xạ cao.
4.4.1.3- Enzyme Taq - polymerase
Trớch li từ vi khuẩn Thermocellus aquaticus, là enzyme chịu nhiệt cao, cú tỏc dụng khuyếch đại tổng hợp DNA. Enzyme này chủ yếu sử dụng để
nhõn dũng gen trong phản ứng PCR.
4.4.2- Enzyme phiờn mó ngược (Reverse transferase)
Là enzyme cú khả năng sao chộp bộ gen RNA của retrovirus khi ký sinh trong tế bào chủ tạo ra cDNA, theo chiều 5’ → 3’ cần cú mặt của mồi.
Đõy là giai đoạn cần thiết để tạo ra ngõn hàng cDNA.
Hiện nay trờn thị trường enzyme phiờn mó ngược cú nguồn gốc từ
AMV (Avian Myeloblastosis Virus). Enzyme phiờn mó ngược là một DNA- polymerase 5’ → 3’, cú cỏc đặc tớnh sau:
- Là enzyme phụ thuộc RNA,
- Tổng hợp DNA theo hướng 5’ → 3’, - Cú hoạt tớnh RNase.
Chỳng được ứng dụng để thiết lập ngõn hàng cDNA hoặc tiến hành phản ứng PCR trờn mRNA, ngoài ra, chỳng cũn được sử dụng để xỏc định trỡnh tự DNA bằng phương phỏp sử dụng cỏc didesoxynucleotide của Sanger. 4.4.3- Cỏc enzyme tổng hợp RNA (RNA-polymerase)
Cú ba loại RNA polymerase được sử dụng nhiều nhất hiện nay là SP6 RNA-polymerse cú nguồn gốc từ phage xõm nhiễm Salmonella typhimurium. T3, T7RNA-polymerase được trớch ly từ phage T3 và T7 xõm nhiễm E. Coli.
Cỏc enzyme này hoạt động trờn sợi khuụn DNA xỳc tỏc sự tổng hợp RNA theo hướng 5’ → 3’. Quỏ trỡnh tổng hợp khụng cần mồi nhưng khuụn DNA phải mang promoter đặc trưng của phage. Cỏc enzyme này được ứng
dụng để: - Để tổng hợp cỏc mẫu dũ RNA đỏnh dấu phúng xạ trong phũng thớ
nghiệm.
- Nghiờn cứu bản phiờn mó RNA của một DNA đó được dũng húa nhờ
phương phỏp PCR.
- Xỏc định trỡnh tự DNA được gắn trong một vector cú mang cỏc promoter
đặc trưng của phare SP6, T3 , T7.
Ngoài ra người ta cũn dựng enzyme này tổng hợp lượng lớn RNA từ
DNA được nối ngay sau promoter thớch hợp. 4.4.4- Enzyme terminal - transferase
Enzyme này được trớch ly từ tuyến ức bờ. Cú cỏc đặc tớnh:
- Terminal-transferase xỳc tỏc gắn cựng một loại nucleotide vào đầu 3’−OH tự do của phõn tử DNA để tạo đuụi polynucleotide.
Chỳng được ứng dụng để:
- Thờm đuụi polynucleotide để tạo đầu sole cho phõn tử DNA dựng trong kỹ thuật tạo dũng.
- Đỏnh dấu đầu 3’ (OH) của phõn tử DNA để xỏc định trỡnh tự axit nucleic theo Manxam và Gilbert.
CHƯƠNG V