1. Khỏi niờm, phõn loại và ứng dụng của immunotoxin
2.2.3.Phƣơng phỏp thiết kế vector biểu hiện
Thiết kế vector mang gen hermel: Vector pET-21a(+) được cắt bằng
hai enzyme giới hạn tại hai vị trớ nhận biết của enzyme giới hạn EcoRI và
Số húa bởi Trung tõm Học Liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thành phần Thể tớch (àl) ADN/Plasmid Dung dịch đệm 4 BSA NotI H20 Thành phần Thể tớch (àl) Plasmid Dung dịch đệm 2 EcoRI H20
NotI, gen mó hoỏ độc tố miễn dịch hermel trong vector tỏch dũng TOPO PCR 2.1 cũng được cắt bằng hai enzyme trờn. Sản phẩm cắt được tinh sạch và điện di trờn gel agarose 0.8%, sau đú được gắn vào vector biểu hiện pET-21a(+) bằng T4 ligase (BioLabs).
Sau khi gắn sản phẩm được biến nạp vào E.coli chủng TOP10. Cỏc khuẩn lạc mang vector tỏi tổ hợp được chọn lọc trờn đĩa mụi trường LB đặc cú bổ sung Apicilli (100 μg/ml) và được nuụi trong mụi trường LB lỏng (cú chứa ampicillin), Plasmid ADN sau đú được tỏch ra để kiểm tra sự cú mặt của gen mong muốn bằng PCR với cặp mồi Anti-Her2F và Anti-Her2R.
Sản phẩm thụi gel được gắn vào vector pET21a(+) cũng đó được cắt với 2 enzyme giới hạn EcoRI và NotI. Cỏc dũng tế bào cú chứa vector tỏi tổ hợp mang gen mó hoỏ độc tố miễn dịch được chọn lọc bằng cỏch so sỏnh kớch thước tương đối của ADN plasmid cũng như kết quả cắt kiểm tra bằng cỏc enzyme giới hạn EcoRI và NotI.
Kết quả này cũn được khẳng định bởi việc xỏc định trỡnh tự nucleotide của gen hermel sau khi được gắn vào vector biểu hiện pET21a(+) tại cỏc vị trớ nhận biết của enzyme giới hạn EcolRI và NotI. Gen hermel chứa cỏc vựng chức năng cũng như mó mở đầu, mó kết thỳc theo đỳng thiết kế (xem phần phõn tớch trỡnh tự dưới đõy). Trỡnh tự gen hermel đó được đăng ký trong Ngõn hàng gen quốc tế với mó số: AM402973. Plasmid chứa gen hermel sau khi được xỏc định trỡnh tự được tinh sạch và biến nạp vào E.coli chủng Rosetta để biểu hiện gen tỏi tổ hợp ở nhiệt độ 37oC sau 4h cảm ứng với nồng độ 0.6 mM IPTG.
Plasmid tỏi tổ hợp pET-21a(+)/HER2
Chủng E. coli BL21 (DE3)
Biến nạp
Chủng E. coli BL 21 (DE3) mang plasmid tỏi tổ hợp pET-21a(+)/HER2 Biểu hiện Protein tỏi tổ hợp (độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2) Tinh sạch scFv đặc hiệu HER2
Hỡnh 2.1. Sơ đồ túm tắt quỏ trỡnh biểu hiện độc tố miễn dịch đặc hiệu khỏng nguyờn Her2 trong E. coli
Chỳ thớch: Biến nạp:
Biểu hiện:
- Làm tế bào khả biến (chủng E. coli BL 21 (DE3)) - Biến nạp plasmid tỏi tổ hợp vào tế bào khả biến - Cảm ứng bằng IPTG
- -
Xử lý mẫu