2.3.2.1. Khám sàng lọc
- Khám lâm sàng để xác định bệnh - Làm bệnh án theo các biến số sau
+ Ghi lại số hồ sơ của bệnh nhân: Là số lưu trữ của bệnh nhân trên sổ khám bệnh và trên hệ thống máy tính của bệnh viện.
+ Hỏi bệnh để xác định các thông tin một số đặc điểm dịch tễ như: tuổi, giới, địa chỉ, dân tộc, trình độ học vấn, nghề nghiệp, tình trạng gia đình.
+ Thời gian phát bệnh đầu tiên: < 2 tuổi, từ 2-12 tuổi và > 12 tuổi + Tiền sử cá nhân và gia đình mắc các bệnh cơ địa như:
* Hen phế quản: Có bệnh khi bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng của hen phế quản (khó thở từng cơn, co kéo kèm tiếng ran rít) và đã từng được Bác sĩ chuyên khoa hô hấp chẩn đoán và điều trị hen.
* Viêm mũi dị ứng: Có bệnh khi bệnh nhân có triệu chứng viêm mũi dị ứng (thường bị nghẹt mũi vào buổi sáng hay thời tiết lạnh hay khi tiếp xúc với phấn hoa, bụi, lông thú…) và từng được Bác sĩ chuyên khoa Tai Mũi Họng chẩn đoán và điều trị viêm mũi dị ứng.
* Viêm da cơ địa: Có bệnh khi bệnh nhân có triệu chứng của VDCĐ (sẩn hoặc mảng ban đỏ, ấn kính mất màu, giới hạn không rõ, trên bề mặt có mụn nước, vết tích mụn nước hoặc là mảng da dày lichen hoá, bệnh thường tái phát nhiều lần) và cũng từng được Bác sĩ chuyên khoa Da liễu chẩn đoán và điều trị VDCĐ.
+ Xác định các yếu tố làm khởi phát bệnh: Các dị nguyên từ thức ăn, các dị nguyên trong không khí, các dị nguyên tiếp xúc
- Đánh giá mức độ bệnh theo SCORAD
* A: độ lan rộng của thương tổn tính bằng “luật số 9” theo phần trăm diện tích cơ thể.
Hình 2.1: Phần trăm diện tích da theo vùng cơ thể
* B: mức độ tổn thương, đánh giá các triệu chứng ban đỏ (erythema),
sẩn/phù (edema/papules), tiết dịch/vảy tiết (oozing/crusts), xước da
(excoriations), liken hóa (lichenification), khô da (dryness) ở vùng không có sang thương.
Sử dụng thang điểm 0-3 (không, nhẹ, trung bình, nặng) để tính cho mỗi triệu chứng trên.
B là tổng điểm của các triệu chứng.
Bảng 2.1: Điểm của các thương tổn
Các thương tổn Mức độ nặng
(Từ 0-3 điểm) Ban đỏ
Sẩn/Phù
Tiết dịch/vảy tiết Xước da
Lichen hóa
Khô da (vùng da lành)
* C: độ ngứa và mất ngủ trong 3 ngày đêm gần đây. Bệnh nhân tự đánh giá mức độ nặng dựa trên thang điểm từ 0-10 cho mỗi triệu chứng.
+ Tổng điểm SCORAD từ 0-103.
+ Độ nặng của bệnh được phân thành 3 mức, dựa vào SCORAD * Nhẹ: SCORAD < 25
* Trung bình: SCORAD 25-50 * Nặng: SCORAD > 50
- Đánh giá giai đoạn bệnh
+ Giai đoạn cấp: Đỏ da, phù nề, chảy nước nhiều.
+ Giai đoạn bán cấp: Giảm đỏ, giảm phù nề, hơi rớm dịch. + Giai đoạn mạn tính: Da dày, thâm da, lichen hóa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.2.2. Nuôi cấy xác định TCV và gen mã hóa SKN của TCV
- Nhóm VDCĐ: Nuôi cấy, xác định TCV trên tổn thương của tất cả các bệnh nhân nghiên cứu. Các trường hợp TCV (+) sẽ được xác định gen mã hóa SKN của TCV.
- Nhóm đối chứng: Người khỏe mạnh, > 12 tuổi sẽ được nuôi cấy xác định tỉ lệ TCV ở vùng da quanh lỗ mũi ngoài (vì đây là vùng mà tỉ lệ TCV (+) cao nhất trên da của người khỏe mạnh). Các trường hợp TCV (+) sẽ được xác định gen mã hóa SKN.
- Kỹ thuật nuôi cấy xác định TCV : + Vị trí lấy bệnh phẩm
* Nhóm nghiên cứu: Tại thương tổn mới.
* Nhóm đối chứng: Vùng da quanh lỗ mũi ngoài (mục 1.2.1.2.)
Dùng tăm bông vô trùng lấy bệnh phẩm từ thương tổn của bệnh nhân VDCĐ và vùng da lành quanh lỗ mũi ngoài của nhóm chứng, sau đó cho vào môi trường vận chuyển MSA (Mannitol Salt Agar) có nồng độ NaCl 7,5% có thể ức chế phần lớn các vi khuẩn khác ngoại trừ TCV, vận chuyển đến phòng xét nghiệm trong vòng 24 giờ. Bệnh phẩm được cấy trong môi trường thạch
máu (Blood agar). Ủ ở 35-37 º C, nồng độ CO2 5%, vi khuẩn sẽ mọc trong
vòng 12 đến 24 giờ.
+ Các bước xác định TCV
* Quan sát khuẩn lạc : Khuẩn lạc có kích thước trung bình đến lớn, nhẵn, nguyên khối, mờ, màu vàng kem.
* Nhuộm Gram và các thử nghiệm định danh TCV theo sơ đồ sau
Sơ đồ 2.1: Các bước định danh TCV
(-) (+)
Nhuộm gram Cầu khuẩn gram (+) Catalase và Oxidase
Liên cầu (Streptococci) Tụ cầu (Staphylococci)
(+)
(-)
Coagulase
- Kỹ thuật xác định các gen mã hóa SKN : Xác định các gen mã hóa SKN (SEA, SEB, SEC, SED, SEE) được thực hiện bằng kỹ thuật Multiplex PCR (Polymerase Chain Reaction).
1. + Nguyên tắc: PCR là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt độ. Một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai
đoạn. Giai đoạn biến tính: đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 94oC, ở nhiệt độ
này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị
biến tính thành các mạch đơn. Giai đoạn ghép cặp: kế đó nhiệt độ sẽ được hạ
đến 55oC-65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến ghép cặp bổ
sung vào hai đầu của đoạn DNA đích. Cuối cùng, nhiệt độ được đưa lên 72oC
là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang ghép cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung. Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao, nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản
được thành 230 đến 240 bản sao, tương đương đến hàng tỷ bản sao.
+ Multiplex PCR phát hiện độc tố TCV
* Nguyên tắc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Thuốc thử được cung cấp
-DNA
PCR
Bảng 2.2: Thuốc thử làm PCR được sản xuất bởi công ty Nam Khoa đạt ISO 9001:2000 và GMP/GLP của WHO.
Tên thuốc thử Thành phần Số lượng ĐK bảo quản
NKMLP-SauET- PCR Mix Mồi, MgCl2, Tris HCl, KCl, taq polymerase, dNTP, UNG, dUTP. 45µl x 50 -18 đến -30oC Chứng (-) TE 1X 1000µl x 1 -18 đến -30oC * Phương pháp
Mẫu thử: Canh cấy vi khuẩn
Phương pháp Bước 1: Trích biệt DNA
Mẫu thử được cấy trên môi trường agar thích hợp
Tăng sinh khuẩn lạc trong môi trường BHI broth trong 4giờ
Ly tâm 150µl dịch tăng sinh này ở 13000rpm trong 5 phút.
Đổ bỏ nước nổi bên trên, hòa cặn lại trong 150µl dung dịch TE
1X,vortex đều cho cặn hòa tan hoàn toàn trong dung dịch.
Đun sôi dịch vi khuẩn này trong 10 phút, để ngay vào đá lạnh 5 phút.
Sau đó ly tâm 13000rpm trong 5 phút. Sử dụng dịch nổi bên trên để thực hiện phản ứng PCR.
Bước 2: Cho vào PCR mix để chuẩn bị chạy PCR (phải thực hiện giai đọan này với các PCR mix giữ trong khay lạnh hay đá bào).
Đối với mỗi mẫu trích biệt DNA từ các mẫu thử: Cho 5 µl mẫu trích biệt DNA vào một tube PCR chứa 45 µl NKMLP-toxin-PCR mix
Đối với chứng (-): Ứng với mỗi lần thực hiện thử nghiệm, phải có một tube NKMLP-toxin-PCR mix cho thêm 5 µl chứng (-).
Bảng dưới đây minh hoạ cách cho các DNA mẫu thử, chứng (-) (dưới đây là ví dụ với 5 mẫu thử) vào các ống chứa 45µl NKMLP-toxin-PCR mix.
Bảng 2.3: Cách cho các DNA mẫu thử và chứng (-) vào các ống chứa 45µl NKMLP-toxin-PCR mix.
Chứng (-) 5µl D N A t ừ m ẫu M ẫ u 1 5µl M ẫ u 2 5µl M ẫ u 3 5µl M ẫ u 4 5µl M ẫ u 5 5µl Thể tích phản ứng 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl
Bước 3: Cho các tube PCR mix ở trên vào buồng ủ nhiệt của máy PCR, chạy chương trình luân nhiệt như sau:
1 chu kỳ 40oC trong 10 phút
1 chu kỳ 95oC trong 5 phút
15 chu kỳ 94oC trong 30 giây
55oC trong 30 giây
72oC trong 1 phút
40 chu kỳ 94oC trong 30 giây
60oC trong 30 giây (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
72oC trong 1 phút
1 chu kỳ 72oC trong 10 phút
Bước 4: Phân tích kết quả: Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di nhúng chìm phân tích sản phẩm PCR. Biện luận kết quả như sau:
Hình sau đây minh họa một phần kết quả điện di sản phẩm PCR từ các mẫu thử.
Hình 2.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR
2.3.2.3. So sánh hiệu quả điều trị VDCĐ giai đoạn bán cấp ở nhóm uống cefuroxim kết hợp với bôi betamethasone dipropionate 0,05% với nhóm bôi betamethasone dipropionate 0,05% đơn thuần.
Chia ngẫu nhiên các bệnh nhân VDCĐ bán cấp, đủ tiêu chuẩn vào giai đoạn thử nghiệm lâm sàng thành hai nhóm.
- Nhóm 1 : được điều trị bằng phác đồ 1, gồm Kết quả điện di
Giếng Vạch# Vạch# Vạch# Vạch# Vạch# Biện luận kết quả
Mẫu Có Không Không Không Không Dương tính với SEA
Không Có Không Không Không Dương tính với SEB
Không Không Có Không Không Dương tính với SEC
Không Không Không Có Không Dương tính với SED
Không Không Không Không Có Dương tính với SEE
Chứng (-) Không ngoại nhiễm
Bị ngoại nhiễm PCR mix kém*
MK MK Thang DNA markers, steps 100bps 1,2 Gen mã hóa độc tố A 3,4 Gen mã hóa độc tố B 5,6 Gen mã hóa độc tố C 7,8 Gen mã hóa độc tố D 1 2 3 4 5 6 7 8 MK
+ Tắm bằng thuốc tím pha loãng 1/10.000.
+ Kháng histamine uống (fexofenadin 60 mg, sáng 1 viên, chiều 1 viên)
+ Bôi Beprosone ® 2 lần/ngày.
+ Cefuroxim 500mg, sáng 1 viên, chiều 1 viên.
- Nhóm 2: được điều trị bằng phác đồ 2, gồm + Tắm bằng thuốc tím pha loãng 1/10.000.
+ Kháng histamine uống (fexofenadin 60 mg, sáng 1 viên, chiều 1 viên)
+ Bôi Beprosone® 2 lần /ngày.
- Thời gian điều trị cho mỗi nhóm: 2 tuần - Cách đánh giá kết quả
+ Đánh giá diễn biến các tổn thương trên lâm sàng và thang điểm SCORAD sau mỗi tuần điều trị.
+ Cấy TCV ở tuần thứ 2.
Trong quá trình điều trị nếu xảy ra bất kỳ dấu hiệu nào không dung nạp thuốc thì sẽ cho ngưng điều trị ngay.
- Đánh giá tác dụng phụ: Rối loạn tiêu hóa, đỏ da, ngứa hơn…
Tóm tắt quy trình nghiên cứu Nhóm 1: 37 bn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Đủ tiêu chuẩn vào giai đoạn thử nghiệm lâm sàng
- Dùng phác đồ điều trị 1
Nhóm 2: 37 bn
- Đủ tiêu chuẩn vào giai đoạn thử nghiệm lâm sàng - Dùng phác đồ điều trị 2 5 bn không tái khám Điều trị 2 tuần 1 bn không tái khám - Xử lý, phân tích số liệu - So sánh hiệu quả điều trị
Nhóm 1: 36 bn - Thương tổn lâm sàng - SCORAD (trước,sau) - Cấy TCV Nhóm 1: 32 bn - Thương tổn lâm sàng - SCORAD (trước,sau) - Cấy TCV 128 bn VDCĐ
- Nghiên cứu dịch tễ, lâm sàng - Xác định tỉ lệ TCV và gen mã hóa SKN của TCV 40 Người khỏe mạnh - Ghi nhận các đặc điểm dịch tễ - Xác định TCV và gen mã hóa SKN của TCV
Sơ đồ 2.2: Tóm tắt quy trình nghiên cứu