Chương II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập và nhân nuôi nấm trên môi trường PDA
2.3.1.1. Phương pháp phân lập
Sau khi thu thập nấm trong môi trường tự nhiên thì tiến hành phân loại sơ bộ loài. Các loài được định loại dựa vào đặc điểm hình thái bên ngoài, màu sắc, cấu trúc của dạng sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính. Cũng có thể phân loại theo côn trùng bị nhiễm nấm. Tiến hành quan sát bào tử để định dạng chính xác. Dựa vào cấu trúc bào tử (kích thước và hình dạng), quả thể, sợi nấm và màu sắc ở bên ngoài.
Phân lập nấm ký sinh côn trùng theo phương pháp của Goettel và Inglis (1997) và nhân nuôi sơ cấp chủng nấm Isaria javanica trên môi trường PDA theo phương pháp của Brown và Smith và Luangsa-ard J.J và cs. (2005).
Từ mẫu nấm gốc đã thu thập được tiến hành phân lập trên môi trường PDA. Mỗi đĩa môi trường tiến hành cấy 3 – 5 điểm.
Từ các đĩa petri đã được phân lập thành công tiến hành cấy chuyển sang nhiều đĩa môi trường PDA để theo dõi khả năng sinh trưởng, phát sinh bào tử và làm nguyên liệu để nhân nhanh sinh khối trên các môi trường rắn.
Mỗi đĩa petri tiến hành cấy 5 điểm đều nhau.
Các thao tác được tiến hành một cách vô trùng và được tiến hành trong buồng cấy vô trùng.
Các đĩa đã được cấy nấm được nuôi trong tủ định ôn ở nhiệt độ 25oC, ẩm độ 75% RH.
2.3.1.2. Phương pháp chuẩn bị môi trường PDA
Phương pháp chuẩn bị môi trường theo Nguyễn Xuân Thành và cs[24] * Chuẩn bị môi trường PDA:
- Thành phần: Khoai tây (potato): 200g Dextrose (Glucose): 20 gam Agar: 15 gam Nước cất: 1000ml
- Cách điều chế: + Khoai tây rửa sạch, gọt vỏ, bỏ chồi và những chỗ thương tổn, sau đó đem rửa lại và cắt nhỏ.
+ Cho khoai tây vào nồi cùng với 1000ml nước cất đun sôi khoảng 15 phút.
+ Lọc lấy dịch nước khoai tây (qua vải lọc), cho lượng agar, đường đã cân vào khuấy đều, cho thêm nước cất để đủ 1000ml. Đun sôi và đem
hấp tiệt trùng ở 121oC (1,5atm) trong thời gian 30 phút. Để nguội tới 55 – 60oC trước khi phân phối vào các dụng cụ phân lập hay nuôi cấy.
* Đổ môi trường PDA ra các đĩa petri
Các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt trùng.
Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương, khéo léo và được tiến hành trong tủ vô trùng nhằm hạn chế sự nhiễm khuẩn.
- Đổ môi trường vào đĩa, đậy nắp đĩa, để đông tự nhiên. - Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2mm.
- Sau khi đổ môi trường vào đĩa pêtri, 1 - 2 ngày sau khi kiểm tra lại xem môi trường có bị nhiễm khuẩn không rồi mới sử dụng để cấy hay phân lập.
- Viết vào nhãn: Tên môi trường ... Khử trùng ngày ... tháng ... năm ...
- Để vào nơi cất giữ môi trường để tiện cho việc theo dõi, sử dụng và bảo quản.