Chương II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.3.3.Phương pháp đếm nồng độ bào tử
- Phương pháp xác định trực tiếp số lượng bào tử bằng phiến kính có khung đếm Goriaep (phòng đếm hồng cầu).
* Phương pháp đếm
Đối với môi trường PDA: Dùng dao cắt lấy 1cm2 khuẩn lạc nấm cho vào 1 bình tam giác có thể tích 50ml chứa 10ml nước cất và Tween 80 (0,05%). Dùng máy lắc trong 5 phút, lọc hỗn dịch qua hai lớp vải muslin và pha loãng theo dãy thập phân (nếu cần) và đếm bào tử bằng phòng đếm hồng cầu.
Đối với môi trường rắn: Cân10 gam hỗn hợp cả cơ chất môi trường và nấm, cho vào bình tam giác thể tích 250ml có chứa 100ml nước cất và Tween 80 (0,05%), lắc bằng máy lắc trong 10 phút. Hỗn dịch được lọc qua 2 lớp vải muslin. Pha loãng hỗn dịch nhiều lần theo dãy thập phân (nếu cần) và đếm bào tử bằng cách sử dụng phòng đếm hồng cầu để tính được lượng bào tử trong 1 gam môi trường [37]
* Sử dụng phòng đếm
Bước 1: Nhỏ một giọt bào tử đã pha loãng lên mỗi trường của buồng đếm, giọt dung dịch nấm vừa đủ để phủ kín ô vuông trên buồng đếm, đặt la men lên.
Bước 2: Đặt phòng đếm lên kính hiển vi với vật kính có độ phóng đại nhỏ nhất, điều chỉnh kính để thấy được trường đếm thứ nhất. Sau đó đưa về vật kính 20 x 40 để thấy rõ các bào tử trong các ô vuông. Chỉnh kính để thấy được các ô vuông lớn ở giữa có chứa các ô vuông nhỏ.
Bước 3: Đếm số lượng bào tử trong năm ô vuông lớn (mỗi ô vuông lớn có chứa 16 ô vuông nhỏ) nằm trên đường chéo của 25 ô vuông lớn ở trường đếm thứ nhất.
Tiếp tục ta điều chỉnh kính về phía trường đếm thứ hai và làm tương tự đếm số lượng bào tử trong 5 ô vuông lớn ở trường đếm thứ hai.
* Phương pháp tính nồng độ bào tử:
Cách tính nồng độ bào tử nấm (Lomer C. H. and Lomer C. J., 1998) [38] như sau : thể tích của một ô lớn là 1/25mm2 x 1/10mm = 1/250mm3 hay 1/250 x 103 cm3 = 4 x 10-6 ml. Như vậy, mật độ tế bào của huyền phù mẫu là : N/ml = 0,25a x n x 106 tế bào/ml (trong đó a là số tế bào bình quân trong một ô lớn, n là số lần pha loãng).