6. Ligase (synthetase)
4.2. Tách và làm s ch (tinh c h) enzyme ế
4.2.1 Ngu n nguyên li uồ ệ
Enzyme có trong t t c các c th đ ng v t, th c v t và vi sinh v t. M t sấ ả ơ ể ộ ậ ự ậ ậ ộ ố
nguyên li u thệ ường dùng làm ngu n nguyên li u đ tách enzyme nh :ồ ệ ể ư
Enzyme hay có m t các c quan d tr nh h t, c , qu , lá. C quan d trặ ở ơ ự ữ ư ạ ủ ả ơ ự ữ
giàu ch t gì thì nhi u enzyme chuy n hóa ch t y. ấ ề ể ấ ấ
- H t th u d u (tách lipase)ạ ầ ầ
- H t đ u tạ ậ ương (tách enzyme urease).
- H t lúa, thóc đ i m ch n y m m (tách ạ ạ ạ ả ầ α - amylase)
- C khoai lang (tách ủ β - amylase)
- Nh a đu đ xanh (tách papain)ự ủ
- Các b ph n (lá, thân, qu ) cây d a ( tách bromelain)ộ ậ ả ứ
- D ch ép thân và lá cây Ficus (tách fixin)ị
4.2.1.2 Ngu n đ ng v tồ ộ ậ
Trong t t c các nguyên li u có ngu n g c đ ng v t thì tuy n t y, màng nh yấ ả ệ ồ ố ộ ậ ế ụ ầ
d dày, tim, gan, lá lách... dùng đ tách enzyme r t thu n l i. ạ ể ấ ậ ợ
- T y t ng giàu enzyme nh t có th dùng đ tách trypsine, amylase, lipase,ụ ạ ấ ể ể
protease, ribonuclease và m t s enzyme khác.ộ ố
- T ngăn t c a d dày bê nghé có th thu nh n ch ph m renin đ làmừ ư ủ ạ ể ậ ế ẩ ể
đông s a trong s n xu t fomat. Ngữ ả ấ ười ta cũng s n xu t pepsin t d dày đ ng v t.ả ấ ừ ạ ộ ậ
Nh ng khác v i pepsin, renin có kh năng đông t s a cao mà không th y phân sâuư ớ ả ụ ữ ủ
s c casein. Renin là ch ph m enzyme có giá tr l n trong công nghi pắ ế ẩ ị ớ ệ
Nguyên li u đ ng v t dùng đ tách enzyme ph i tệ ộ ậ ể ả ươ ố ấi t t l y ngay sau khi đ ngộ
v t vùa b gi t ch t ho c b o qu n nhi t đ 20ậ ị ế ế ặ ả ả ở ệ ộ 0C 4.2.1.3 Ngu n vi sinh v tồ ậ
Vi sinh v t thậ ường dùng đ s n xu t ch ph m enzyme g m nhi u loài thu cể ả ấ ế ẩ ồ ề ộ
Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clostridium, Streptomyces và m t s loài n mộ ố ấ
men.
Trong các ngu n nguyên li u, vi sinh v t là ngu n nguyên li u thích h p nh tồ ệ ậ ồ ệ ợ ấ
đ s n xu t enzyme quy mô l n dùng trong công nghi p. Dùng ngu n vi sinh v tể ả ấ ở ớ ệ ồ ậ
có nh ng l i ích chính nh sau:ữ ợ ư
- Có th ch đ ng v ngu n nguyên li u.ể ủ ộ ề ồ ệ
- Chu kỳ sinh trưởng c a vi sinh v t ng n (t 16 - 100 gi ) do đó có th thuủ ậ ắ ừ ờ ể
- Enzyme vi sinh v t có ho t tính r t m nh, vậ ạ ấ ạ ượt xa các sinh v t khác. Vì v yậ ậ
ch c n m t lỉ ầ ộ ượng nh enzyme có th chuy n hóa m t lỏ ể ể ộ ượng l n c ch t.ớ ơ ấ
- Có th đi u khi n s t ng h p enzyme d dàng h n các ngu n nguyên li uể ề ể ự ổ ợ ễ ơ ồ ệ
khác đ tăng lể ượng enzyme đượ ổc t ng h p ho c t ng h p đ nh hợ ặ ổ ợ ị ướng enzyme.
- Giá thành th p vì môi trấ ường nuôi c y vi sinh v t tấ ậ ương đ i đ n gi n, rố ơ ả ẻ
ti n,...ề
Tuy nhiên c n l u ý m t s vi sinh v t có kh năng sinh đ c t , vì v y c n cóầ ư ộ ố ậ ả ộ ố ậ ầ
bi n pháp x lý thích h p. ệ ử ợ
Đ s n xu t các ch ph m enzyme t vi sinh v t bao g m các giai đo n chể ả ấ ế ẩ ừ ậ ồ ạ ủ
y u sau:ế
- Tuy n ch n, c i t o và b o qu n gi ng: ngể ọ ả ạ ả ả ố ười ta ti n hành phân l p t môiế ậ ừ
trường nhiên ho c gây đ t bi n b ng các phặ ộ ế ằ ương pháp sinh h c, lý, hóa h c... đọ ọ ể
t o ch ng có kh năng siêu t ng h p enzyme.ạ ủ ả ổ ợ
- L a ch n môi trự ọ ường nuôi c y vì thành ph n môi trấ ầ ường dinh dưỡng có nhả
hưởng tr c ti p đ n s sinh trự ế ế ự ưởng và t ng h p enzyme c a vi sinh v tổ ợ ủ ậ
- Nuôi c y vi sinh v t: có hai phấ ậ ương pháp nuôi c y khác nhau v nguyên t cấ ề ắ
+ Phương pháp nuôi c y b m t: vi sinh v t phát tri n và bao ph trênấ ề ặ ậ ể ủ
b m t môi trề ặ ường dinh dưỡng r n, đã đắ ược làm m và vô trùng.ẩ
Ch ph m thu đế ẩ ượ ở ạc d ng r n - thô. ắ
+ Phương pháp nuôi c y b sâu: vi sinh v t phát tri n trong môiấ ề ậ ể
trường l ng có s c khí và khu y đ o liên t c, thu đỏ ụ ấ ả ụ ược canh trường l ng - d ng thô. ỏ ạ
- Tách và tinh ch enzyme: đ thu ch ph m tinh khi t ế ể ế ẩ ế
4.2.2 Thu h i ch ph m enzyme ồ ế ẩ
Enzyme có m t trong m i t bào c th s ng. Các enzyme có th ti t ra ngoàiặ ọ ế ơ ể ố ể ế
môi trường (enzyme ngo i bào) ho c c trú bên trong t bào (enzyme n i bào) ạ ặ ư ế ộ
Đ i v i enzyme n i bào:ố ớ ộ mu n chi t rút enzyme ra kh i t bào c n:ố ế ỏ ế ầ
- Phá v c u trúc t bào b ng nhi u phỡ ấ ế ằ ề ương pháp nh c h c (nghi n v iư ơ ọ ề ớ
b t th y tinh ho c cát th ch anh, làm đ ng hóa b ng thi t b đ ng hóa), dùng tácộ ủ ặ ạ ồ ằ ế ị ồ
d ng c a sóng siêu âm, c a các dung môi h u c (butanol, aceton, glycerin, ethylụ ủ ủ ữ ơ
- Sau đó, enzyme được chi t b ng các dung môi khác nhau nh nế ằ ư ước c t,ấ
dung d ch đ m thích h p, dung d ch mu i trung tính…ị ệ ợ ị ố
- Trong d ch chi t, ngoài enzyme còn có các protein t p và nhi u ch t khác,ị ế ạ ề ấ
đ lo i b chúng ph i s d ng ph i h p nhi u bi n pháp khác nhau. ể ạ ỏ ả ử ụ ố ợ ề ệ
+ Đ lo i b mu i khoáng và các t p ch t có phân t lể ạ ỏ ố ạ ấ ử ượng th p (cácấ
lo i đạ ường…) thường dùng các phương pháp th m tích đ i nẩ ố ước hay đ i các dung d ch đ m loãng (cách làm: cho dung d ch enzymeố ị ệ ị
vào túi colodion ho c cellophane (thông thặ ường người ta dùng cellophane t t h n), sau đó đ t c túi vào nố ơ ặ ả ước c t ho c dung d chấ ặ ị
đ m pha loãng (nh đ m phosphate có pH = 7, n ng đ 0,01Mệ ư ệ ồ ộ
ch ng h n). Màng cellophane là màng bán th m, có kích thẳ ạ ấ ướ ỗc l cho các ch t có phân t nh xuyên và đi qua vào các dung d ch đ mấ ử ỏ ị ệ
loãng theo đ nh lu t khu ch tán. Còn l i trong màng là các ch tị ậ ế ạ ấ
protein có phân t l n) (Hình 4.1) ho c b ng cách l c qua gelử ớ ặ ằ ọ
sephadex.
+ Đ lo i b các protein t p (protein c u trúc, protein tr ) và các t pể ạ ỏ ạ ấ ơ ạ
ch t có phân t lấ ử ượng cao khác, thường dùng k t h p các phế ợ ương pháp khác nhau: phương pháp bi n tính ch n l c nh tác d ng c aế ọ ọ ờ ụ ủ
nhi t đ ho c pH c a môi trệ ộ ặ ủ ường, phương pháp k t t a phân đo nế ủ ạ
b ng mu i trung tính ho c các dung môi h u c , các phằ ố ặ ữ ơ ương pháp s c ký (s c ký h p ph , s c ký trao đ i ion), đi n di, phắ ắ ấ ụ ắ ổ ệ ương pháp l c gel.ọ
Phương pháp bi n tính ch n l c nh tác d ng c a nhi t ho c pH c a môiế ọ ọ ờ ụ ủ ệ ặ ủ
trường ch dùng đ i v i trỉ ố ớ ường h p các enzyme b n v i nhi t ho c b n v i acid.ợ ề ớ ệ ặ ề ớ
D ch enzyme đị ược gi 50 - 70ữ ở 0C hay pH = 5 trong m t th i gian xác đ nh sau đóở ộ ờ ị
Hình 4.1. Th m tích đ lo i mu i (NHẩ ể ạ ố 4)2SO4 trong k t qu proteinế ả
Đ i v i enzyme ngo i bào:ố ớ ạ đ thu d ch enzyme thể ị ường tách sinh kh i và cácố
ch t c n bã ra kh i canh trấ ặ ỏ ường b ng ly tâm ho c l c ép v i vi c s d ng thêm cácằ ặ ọ ớ ệ ử ụ
ch t tr l c (diatomit, than ho t tính…) ho c các ch t t o k t t a khi c n thi tấ ợ ọ ạ ặ ấ ạ ế ủ ầ ế
(CaCl2 + (NH4)2SO4 4 CaSO4, ch t này d dàng b l ng c n kéo theo sinh kh i nênấ ễ ị ắ ặ ố
giúp cho quá trình l c s d dàng h n)ọ ẽ ễ ơ
Cho đ n nay v n ch a tìm đế ẫ ư ược phương pháp tách và làm s ch chung cho cácạ
enzyme. Khi c n tách và làm s ch m t enzyme nào đó c n ch n và ph i h p cácầ ạ ộ ầ ọ ố ợ
phương pháp khác nhau đ xây d ng m t phể ự ộ ương pháp phù h p nh t.ợ ấ
Trong quá trình chi t rút, c n chú ý:ế ầ
- Ph i chi t rút và ti n hành k t t a enzyme nhi t đ th p (t 3 đ n 5ả ế ế ế ủ ở ệ ộ ấ ừ ế 0C) - Các thao tác thí nghi m ph i nhanhệ ả
- Dùng ch t đi n ly thích h p: (NaCl, ZnClấ ệ ợ 2, CaCl2) ph thu c vào phụ ộ ương pháp dùng khi chi t rút. Ví d , dùng máy nung thì c ba ch t trên đ u có tác d ng,ế ụ ả ấ ề ụ
n u ch đ l ng thì ch NaCl có tác d ng.ế ỉ ể ắ ỉ ụ
- Ở ộ đ ng, th c v t, còn có nh hự ậ ả ưởng c a ch t màu đ n vi c làm s ch ho củ ấ ế ệ ạ ặ
xác đ nh ho t đ enzyme. Vì v y, ngị ạ ộ ậ ười ta cho thêm vào ch t kh đ lo i màu. ấ ử ể ạ
Ví d :ụ
+ Màu c a hemoglobin h ng c u ho c c a chlorophyll và m t sủ ở ồ ầ ặ ủ ộ ố
ch t màu khác lá có th b lo i tr b i h n h p ethanol,ấ ở ể ị ạ ừ ở ỗ ợ
chloroform v i t l thích h p. ớ ỷ ệ ợ
+ Ho t đ enzyme superoxide dismutase (SOD) - m t enzyme ch ngạ ộ ộ ố
+ Ở các m u t đ ng v t có s c t melanin màu nâu thẫ ừ ộ ậ ắ ố ường lo i màuạ
trên c t nh a trao đ i ion b ng cách cho d ch enzyme qua c t ho cộ ự ổ ằ ị ộ ặ
l c. Khi qua c t, ch t màu b gi l i và enzyme không b gi . Ngắ ộ ấ ị ữ ạ ị ữ ười ta hay dùng DEAE - cellulose (Diethylamino ethyl - cellulose) ho cặ
than ho t tính. Trong quá trình này ph i chú ý ki m tra pH. Sau khiạ ả ể
lo i màu c n ki m tra l i ho t đ c a enzyme.ạ ầ ể ạ ạ ộ ủ
Sau khi làm s ch c n s y khô các ch ph m enzyme (s y chân không nhi tạ ầ ấ ế ẩ ấ ở ệ
đ th p ho c s y thăng hoa) đ có th s d ng lâu dài. B ng các phộ ấ ặ ấ ể ể ử ụ ằ ương pháp làm s ch khác nhau có th thu đạ ể ược các ch ph m enzyme có ho t tính cao h n nhi uế ẩ ạ ơ ề
so v i ch ph m ban đ u.ớ ế ẩ ầ
Vi c thu ch ph m enzyme tinh khi t và nh t là d ng tinh th r t khó khănệ ế ẩ ế ấ ở ạ ể ấ
và t n kém do đó các ch ph m enzyme lo i này ch đố ế ẩ ạ ỉ ược dùng trong h c và trongọ
m c đích nghiên c u nh xác đ nh kh i lụ ứ ư ị ố ượng phân t enzyme, nghiên c u v c uử ứ ề ấ
trúc enzyme…