6. Ligase (synthetase)
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU ENZYME Ứ 4.1 Nh ng nguyên t c chung khi nghiên c u enzyme ữắứ
Enzyme là nh ng ch t xúc tác sinh h c có b n ch t protein và r t không nữ ấ ọ ả ấ ấ ổ
đ nh. Trong nh ng đi u ki n b t l i, chúng không b n, d b bi n tính và m t ho tị ữ ề ệ ấ ợ ề ễ ị ế ấ ạ
đ . Do đó, khi nghiên c u enzyme c n chú ý tránh nh ng đi u ki n sau:ộ ứ ầ ữ ề ệ
- Đa s enzyme ho t đ ng đố ạ ộ ượ ởc vùng pH trung tính ho c g n nh trungặ ầ ư
tính (pH = 7 ± 2). Vì v y các y u t axit m nh, ki m m nh d gây bi n tínhậ ế ố ạ ề ạ ễ ế
enzyme.
- Khi đi u ch nh pH c a dung d ch đ m có ch a enzyme c n ph i thêm t tề ỉ ủ ị ệ ứ ầ ả ừ ừ
và r t th n tr ng các axit ho c ki m nên ti n hành 0ấ ậ ọ ặ ề ế ở 0C.
- Nh ng ion kim lo i n ng nh chì, đ ng, th y ngân... và các đi u ki n vữ ạ ặ ư ồ ủ ề ệ ề
nhi t đ cao cũng thệ ộ ường làm m t ho t đ enzyme.ấ ạ ộ
- Khi tách và làm s ch enzyme, c n ti n hành nhi t đ th p, thạ ầ ế ở ệ ộ ấ ường t 0ừ 0C đ n 5ế 0C. Đ i v i các enzyme không b n thì đố ớ ề ược ti n hành nhi t đ th p h n (tế ở ệ ộ ấ ơ ừ
- 50C đ n - 20ế 0C). Người ta hay s d ng các h n h p l nh nh nử ụ ỗ ợ ạ ư ước đá v i COớ 2 ho c nặ ước đá v i mu i NaCl, ho c th m chí dùng c h n h p nớ ố ặ ậ ả ỗ ợ ước đá v i axitớ
sulfuric đ m đ c... ậ ặ B ng 4.1. H n h p làm l nhả ỗ ợ ạ Thành ph n h nầ ỗ h pợ T lỷ ệ Nhi t đệ ộ đ tạ được Nước đá: mu iố 100:33 (3:1) - 21,30C Nước đá: H2SO4 đ mậ đ cặ 100: 25 (4:1) - 20,00C
- Tránh t o b t vì nhi u enzyme b bi n tính (m t ho t tính) m t phân cáchạ ọ ề ị ế ấ ạ ở ặ
hai pha nước và khí. Do v y, ngậ ười ta thường rót dung d ch enzyme theo thành ngị ố
th y tinh và không đủ ượ ắc l c.
- Khi c t, thái, xay nh các m u th c v t và đ ng v t (lá cây, th t, các cắ ỏ ẫ ự ậ ộ ậ ị ơ
quan n i t ng...) không dùng các d ng c dao kéo, d ng c xay đã han r đ tránhộ ạ ụ ụ ụ ụ ỉ ể
tác d ng c a các ion kim lo i n ng nh (Cu, Pb, Fe...) mà nên dùng d ng c inox.ụ ủ ạ ặ ư ụ ụ
- Khi dùng các dung môi h u c nh aceton, alcol đ k t t a enzyme c n ti nữ ơ ư ể ế ủ ầ ế
hành nhi t đ th p. ở ệ ộ ấ
- Tách k t t a enzyme b ng cách ly tâm l nh t t h n l c l nh vì ti n hànhế ủ ằ ạ ố ơ ọ ạ ế
nhanh h n, và c n th c hi n thí nghi m liên t c, không ng t quãng đ tránh gi mơ ầ ự ệ ệ ụ ắ ể ả
ho t đ c a enzyme.ạ ộ ủ
- Khi ti n hành xác đ nh ho t đ c a các enzyme, n u đã xác đ nh trongế ị ạ ộ ủ ế ị
kho ng nhi t đ nào thì t t c các thành ph n c a h n h p ph n ng ph i đả ệ ộ ấ ả ầ ủ ỗ ợ ả ứ ả ược gi nhi t đ y (dùng máy n đ nh nhi t). Khi h n h p ph n ng đã đ t đữ ở ệ ộ ấ ổ ị ệ ỗ ợ ả ứ ạ ược nhi t đ c n thi t thì m i ti n hành đo và pH c n gi n đ nh, chính xác.ệ ộ ầ ế ớ ế ầ ữ ổ ị
- Đ đ m b o k t qu tin c y, tránh sai s nhi u, ph i l y th t chính xácể ả ả ế ả ậ ố ề ả ấ ậ
lượng d ch enzyme, thị ường dùng các lo i micropipette.ạ
- Trong khi thí nghi m c n chú ý tránh đánh r i enzyme vào dung d ch nghiênệ ầ ơ ị
c u. Ví d , đang làm thí nghi m v i amylase ch ng h n thì không nói chuy nứ ụ ệ ớ ẳ ạ ệ
nhi u. ề
- Khi đã có ch ph m enzyme, c n b o qu n chúng nhi t đ th p, gi cácế ẩ ầ ả ả ở ệ ộ ấ ữ
k t t a d ng huy n phù trong dung d ch ammoni sulphate bão hòa và l y chế ủ ở ạ ề ị ấ ế
ph m ra b ng cách ly tâm. ẩ ằ
- S y khô ch ph m enzyme đi u ki n chân không ho c dùng phấ ế ẩ ở ề ệ ặ ương pháp đông khô.