Khi đo độ hấp thụ, câc nhă nghiín cứu hay dùng mây quang phổ kế (còn gọi lă mây so mău). Sơđồ cấu tạo mây quang phổ kếđược mô tả trín hình 8.8.
1 2 3 4 5
0
Hình 8.8: Sơđồ cấu tạo mây quang phổ kế
1) Nguồn chiếu sâng 2) Kính lọc bước sóng ânh sâng 3) Cốc đựng mẫu (cuvĩt) 4) Tế băo quang điện 5) Măn hình thiết bịđo giâ trị mật độ quang học (D) hay độ truyền qua (T)
Nguyín tắc đo: Cho dung môi (chất dùng để pha dung dịch nghiín cứu) văo ống thủy tinh số 3 vă chỉnh thiết bị đo số 5, cho kim chỉ số không. Sau đó đổ dung môi ra, trâng sạch, sấy khô, để nguội rồi đổ dung dịch nghiín cứu văo, trín măn hình thiết bịđo số 5, kim sẽ chỉ giâ trị mật độ quang học D hay độ truyền qua T. Lưu ý cả dung môi vă dung dịch nghiín cứu đều đo ở bước sóng đê được chọn trước. Ví dụđo mật độ quang học của dung dịch ADN thì phải chọn bước sóng λ=260nm. Mỗi chất hấp thụ cực đại ở một bước sóng nhất định (ký hiệu lă λmax) vă khi chiếu ânh sâng λmax, đối với mỗi chất có một hệ số
hấp thụ xâc định (ký hiệu lă kmax). Song cũng có những chất hấp thụ cực đại ở một số
bước sóng khâc nhau như triptophan, tirozin, phenilalanin vă do vậy chúng cũng có câc hệ số hấp thụ tương ứng (xem bảng 8.1).
Bảng 8.1: Độ hấp thụ vă hệ số hấp thụở bước sóng λmax.
Câc chất λmax (nm) kmax
Tirozin 274; 222; 193 (1,4; 8; 48).10-3 Phenilalanin 257; 206; 188 (0,2; 9,3; 60).10-3 Triptophan 280; 219 (5,6; 47).10-3 Hixtidin 211 5,9.10-3 Xistein 250 0,3.10-3 Adenin 260,5 13,4.10-3 Adenozin 259,5 14,9.10-3 Guanozin 252,5 13,6.10-3 Guanin 246 10,7.10-3 Xitozin 267 6,1.10-3 Xitidin 271 9,1.10-3
Uraxin 261,1 10,1.10-3 Timin 264,5 7,9.10-3 Timidin 267 9,7.10-3
ADN 260 6,6.10-3
ARN 258 7,4.10-3
Phương phâp đo quang phổ hấp thụ trong vùng tử ngoại vă ânh sâng nhìn thấy được âp dụng để xâc định nồng độ. Vì theo định luật Lambert - Beer thì mật độ quang học (D) tỷ
lệ thuận với nồng độ dung dịch (C). Vì vậy, muốn xâc định nồng độ của một chất cần nghiín cứu thì trước tiín phải có đồ thị chuẩn D = f(λ) của chất nghiín cứu chuẩn (tự lăm hay lấy từ tăi liệu tham khảo (xem hình 8.2). Sau đó lấy dung dịch chất cần nghiín cứu
đo được giâ trị mật độ quang học lă Dx, dựa văo đồ thị chuẩn sẽ suy ra được nồng độ Cx.
Để xâc định nồng độ vi khuẩn (Cvk) câch lăm cũng tương tự, chỉ việc thay nồng độ phđn tử
gam (M) bằng số lượng vi khuẩn trong 1ml vă
đo ở bước sóng λ=650nm (xem hình 8.9). Ví dụ: Từ đồ thị chuẩn D = f(λ=260nm) của dung dịch ADN chuẩn đê biết được nếu D260 (mật độ quang học đo ở λ=260nm) bằng 1 sẽ
tương ứng với nồng độ ADN lă 50 microgam/ml, nếu D260 bằng 0,5 tương ứng với nồng độ ADN lă 25 microgam/ml, nếu D260 bằng 0,1 tương ứng với nồng độ ADN lă 5 microgam/ml. D(650nm) Dx O Cx C D=f(λ) Hình 8.9: Nồng độ vi khuẩn (Cvk) xâc định bằng câch đo mật độ quang học (D)
Phương phâp đo quang phổ hấp thụ còn có thể cho phĩp xâc định thănh phần của phđn tử. Từ bảng 8.1 đê biết hệ số hấp thụ kmax của 4 bazơ Nitơ lă Adenin, Timin, Guanin, Xitozin. Dựa văo bước sóng λmax trong bảng 8.1 sẽđo được mật độ quang học tương ứng của mỗi bazơ Nitơ. Âp dụng công thức (8.10) D = k.C.l vă khi chọn cuvĩt có độ dăy l = 1Cm thì suy ra D = k.C. Khi biết D vă k sẽ tính được nồng độ
k D C= .
* Phương phâp phđn tích hấp thụ nguyín tử
- Phđn tích định tính: Sự hấp thụ của nguyín tử vật chất đối với ânh sâng mang tính chất chọn lọc, nghĩa lă mỗi nguyín tử chỉ hấp thụở một bước sóng ânh sâng nhất định. Điều năy cho phĩp nhận dạng được nguyín tố có mặt trong mẫu đem phđn tích khi so sânh quang phổ hấp thụ của mẫu với quang phổ hấp thụ của câc nguyín tố hoâ học đê biết trước.
- Phđn tích định lượng: Âp dụng định luật Lambert - Beer vă sử dụng công thức (8.10) sẽ
xâc định được nồng độ của chất nghiín cứu khi đo được mật độ quang học D vă hệ số
hấp thụ nguyín tử k ở ânh sâng chiếu có bước sóng xâc định (ânh sâng đơn sắc). Phương phâp phđn tích hấp thụ nguyín tử có độ chính xâc cao hơn nhiều so với phương phâp dùng quang phổ kế.
VII. Quang hợp
1. Phương trình quang hợp tổng quât
Trín trâi đất chỉ có hai nguồn năng lượng mă thế giới sinh vật có thể sử dụng lă năng lượng hoâ học của câc chất vô cơ có nguồn gốc từ trâi đất vă năng lượng ânh sâng có nguồn gốc từ vũ trụ. Năng lượng ânh sâng lă nguồn năng lượng vô tận, có ý nghĩa quyết
định tới sự sống ở trín trâi đất được thực vật vă nhiều loăi vi sinh vật quang dưỡng chuyển hóa thănh năng lượng hoâ học trong câc phđn tử hữu cơ. Nhờ quâ trình quang hợp mă mỗi năm trín trâi đất có 5.1010 tấn chất hữu cơđược tổng hợp, hấp thụ 2.1012 tấn CO2 vă thải ra 13.1010 tấn O2 văo khí quyển. Phản ứng tổng quât của quang hợp lă phản
ứng tổng hợp câc chất hữu cơ (hydratcacbon) từ câc chất vô cơ (khí CO2 vă H2O) dưới tâc dụng của ânh sâng (ký hiệu lă hγ).
6CO2 + 6H2O⎯⎯ →diephγ⎯luc C6H12O6 + 6O2
Quâ trình quang hợp diễn ra ở thực vật bậc cao vă thực vật bậc thấp. Một loại quang hợp khâc diễn ra ở vi khuẩn theo phản ứng:
CO2 + 2H2S ⎯⎯→hγ CH
2O + H2O + 2S
Đối với vi khuẩn, quâ trình quang hợp không thải ra oxy mă thải ra khí lưu huỳnh.
2. Năng lượng trong quâ trình quang hợp
Đểđịnh lượng vai trò của ânh sâng có thể tính tổng năng lượng câc liín kết ở câc chất tham gia văo phản ứng vă câc sản phẩm cuối cùng của quâ trình quang hợp theo phương trình tổng quât sau đđy:
O=C=O+H⎯O⎯H⎯⎯→hγ H⎯C=O+O=O ⏐
H
Ở câc chất tham gia có:
2 nối C=O có năng lượng lă: 2x190 Kcal/M 2 nối O⎯H có năng lượng lă: 2x110 Kcal/M Năng lượng tổng cộng lă: 600 Kcal/M
Ở sản phẩm quang hợp có:
1 nối O=O có năng lượng lă: 1x116 Kcal/M 1 nối C=O có năng lượng lă: 1x190 Kcal/M 2 nối C ⎯H có năng lượng lă: 2x92 Kcal/M Năng lượng tổng cộng lă: 490 Kcal/M
So sânh năng lượng trước vă sau phản ứng ta có: 600Kcal/M-490 Kcal/M=110Kcal/M
Như vậy năng lượng ânh sâng cung cấp cho quâ trình quang hợp cũng chính bằng 110 Kcal/M để phâ vỡ liín kết cũ (chất tham gia) vă hình thănh liín kết mới (sản phẩm). Theo tính toân lý thuyết 1 photon ânh sâng đỏ (λ=690nm) có năng lượng khoảng 42Kcal/M vă như vậy để có 110Kcal/M, thực vật chỉ cần hấp thụ 3 photon ânh sâng đỏ lă đủ thực hiện quâ trình quang hợp. Trín thực tế, theo dẫn liệu của nhiều tâc giảđể tạo ra 1 phđn tử oxy,
tối thiểu phải cần từ 4 đến 12 photon. Nếu lấy giâ trị trung bình số photon cần thiết cho quâ trình quang hợp lă 8 thì hiệu suất trung bình của quâ trình quang hợp sẽ lă:
375 , 0 Kcal 42 photon 8 Kcal 42 photon 3 = × × = η hay đạt 37,5%
Hiệu suất cực đại của quâ trình quang hợp có thểđạt được lă: 75 , 0 Kcal 42 photon 4 Kcal 42 photon 3 = × × = η hay đạt 75% 3. Sắc tố cảm quang
Để thực hiện được quâ trình quang hợp, câc tế băo thực vật, câc vi khuẩn phải có câc sắc tố cảm quang để tiếp nhận năng lượng ânh sâng. Có ba nhóm sắc tố chính lă: Porphyrin, Phycobilin vă Carotenoid.
- Sắc tố nhóm Porphyrin: Tất cả câc loăi thực vật vă vi khuẩn có quang hợp đều chứa Chlorophyll ở câc dạng khâc nhau. Tế băo thực vật chứa Chlorophyll còn vi khuẩn quang hợp chứa Bacteriochlorophyll. Chlorophyll ở câc loăi khâc nhau không đâng kể về cấu trúc phđn tử nhưng lại khâc nhau về quang phổ hấp thụở bước sóng λmax. Câc cơ thể tiến hănh quang hợp thải oxy như thực vật bậc cao, tảo vă vi khuẩn Cyanobacteria hấp thụ
cực đại ở bước sóng 650nm vă 680nm. Vi khuẩn xanh lục chủ yếu chứa Bacteriochlorophyll c, d, e lại hấp thụ cực đại ở bước sóng 725nm; 740nm; 760nm còn vi khuẩn tía chứa Bacteriochlorophyll a hấp thụ cực đại đến bước sóng 950nm vă chứa Bacteriochlorophyll b hấp thụ cực đại ở bước sóng 1020nm đến 1100nm.
- Phycobiliprotein: Lă câc sắc tố mău đỏ hoặc xanh lam, có mặt ở vi khuẩn lam, tảo đỏ, tảo nđu... Nhờ có Phycobiliprotein mă tế băo vi khuẩn lam hấp thụ ânh sâng có bước sóng vùng 450-700nm. Câc sắc tố như Phycoerythrin hấp thụ cực đại ở bước sóng 565nm, Phycocyanin hấp thụ cực đại ở bước sóng 620nm, Allophycocianin hấp thụ cực đại ở
bước sóng 654nm...
- Carotenoid: Nhóm Carotenoid có thể chia lăm ba loại: không vòng, đơn vòng hoặc hai vòng. Ở thực vật bậc cao có mặt Carotenoid thuộc loại hai vòng, ở vi khuẩn tía có Carotenoid thuộc loại không vòng còn ở vi khuẩn xanh có đến 80-85% Carotenoid thuộc loại một vòng. Nhờ có tập hợp câc sắc tố quang hợp đa dạng như vậy nín câc sinh vật có quang hợp đê hấp thụđược hầu hết phổ ânh sâng mặt trời chiếu xuống trâi đất (bước sóng từ 350 đến 1100nm). Sự khâc nhau về vùng ânh sâng bị hấp thụở câc nhóm sinh vật khâc nhau đê lăm cho chúng không phải cạnh tranh với nhau về nguồn năng lượng chiếu sâng.
4. Sự chuyền năng lượng trong quang hợp
Tập hợp câc sắc tố tham gia văo quâ trình quang hợp, giữa chúng có xảy ra sự chuyền năng lượng. Câc nhă khoa học đê tính toân trong gran của lục lạp có nồng độ Chlorophyll rất cao từ 0,1 đến 1M/dm3 vă khoảng câch trung bình giữa câc phđn tử sắc tố chỉ khoảng từ
10 đến 20 . Sự chuyền năng lượng giữa câc phđn tử sắc tố xảy ra theo cơ chế cộng hưởng cảm ứng.
o
A
Ở thực vật bậc cao vă tảo, bằng phương phâp phâ vỡ tế băo, tâch riíng lấy lục lạp vă dùng phương phâp điện di, sắc ký đê tâch được phức hợp sắc tố - protein. Trong thănh phần phức hợp sắc tố - protein có khoảng 50-60% Chlorophyll của tế băo thực vật hay tảo. Trong phức hợp sắc tố năy có hai dạng Chlorophyll phât huỳnh quang cực đại ở bước
sóng 680nm vă 695nm. Vì vậy, người ta cho rằng có hai kính vận chuyển năng lượng, bắt đầu từ sự nhận năng lượng ânh sâng bởi Chlorophyll b sau đó vận chuyển năng lượng cho Chlorophyll a hấp thụ cực đại ở bước sóng 680nm (ký hiệu lă Chl.a (680)) vă Chlorophyll a hấp thụ cực đại ở bước sóng 695nm (Chl.a (695)). Chlorophyll có khả năng hấp thụ ânh sâng chọn lọc, chuyền năng lượng hấp thụđược từ ânh sâng sang cho hệ vận chuyển điện tử quang hợp để chuyển thănh hóa năng. Nhóm sắc tố Carotenoid cũng có khả năng hấp thụ năng lượng ânh sâng rồi chuyển năng lượng cho hệ Chlorophyll để thực hiện quâ trình quang hợp. Nhóm sắc tố Phycobilin cũng có khả năng hấp thụ năng lượng ânh sâng ở vùng bước sóng ngắn vă chuyển năng lượng cho Chlorophyll để thực hiện quâ trình quang hợp.
Ví dụ: Ở vi khuẩn lam, quâ trình vận chuyển năng lượng diễn ra theo chiều hướng sau: Phycoerythrin → Phycocianin → Allophycocianin →
(565nm) (620nm) (654nm) Allophycocianin B → Chlorophyll a.
(671nm) (680nm)
Câc số ghi trong ngoặc ở dưới lă bước sóng hấp thụ cực đại (λmax) của mỗi sắc tố.
5. Cơ chế của quâ trình quang hợp
Quâ trình quang hợp được chia ra 2 giai đoạn (hay 2 pha, được gọi lă pha sâng vă pha tối).
* Pha sâng quang hợp
Đđy lă pha đầu tiín của quang hợp, có sự tham gia trực tiếp của ânh sâng. Sắc tố quang hợp lă Chlorophyll (Chl) đê hấp thụ năng lượng ânh sâng do photon chuyền cho để
chuyển lín trạng thâi kích thích (Chl*) có mức năng lượng cao hơn so với trạng thâi ban
đầu (Chl).
E = hγ→ Chl → Chl*
Điện tử của phđn tử Chlorophyll ở trạng thâi kích thích, khi trở về trạng thâi ban đầu đê chuyển năng lượng cho hệ chuyền điện tửđịnh vị trong lục lạp để tổng hợp nín ATP.
Ở pha sâng quang hợp có sự tham gia của phđn tử nước. Dưới tâc dụng của ânh sâng với sự tham gia của hệ sắc tố vă hệ oxy hóa trong lục lạp mă phđn tử nước bị phđn li, gọi lă sự quang phđn li nước.
Quang phđn li nước xảy ra qua nhiều giai đoạn như sau: 4H2O ⎯⎯ →Sach⎯γto 4H+ + 4OH - 4OH - ⎯⎯ →⎯ 4e - + 4OH 4OH O + + − ⎯ ⎯→ ⎯MnCl 2 + 2H2O Kết quả: 2H2O ⎯⎯ →⎯ 4H+ + 4e - + O2
Oxy được thải văo không khí còn proton (tức H+) vă điện tử (e-) sẽ tham gia văo câc quâ trình tiếp sau. Điện tử được vận chuyển qua hệ vận chuyển điện tử quang hợp để tổng hợp nín ATP còn H+ kết hợp với NADP-để tạo nín NADPH2. Tóm tắt phản ứng của pha sâng như sau:
2H2O + 2ADP + 2H3PO4 + 2NADP ⎯Sac⎯ →h⎯γto 2ATP + 2NADPH2 + O2↑
Sản phẩm của pha sâng lă ATP, NADPH2 sẽ tiếp tục tham gia văo phản ứng tiếp theo của pha tối để tổng hợp nín chất hữu cơ với sự tham gia của CO2.
* Pha tối quang hợp
Câc phản ứng của pha tối diễn ra không có sự tham gia trực tiếp của ânh sâng chiếu mă có sự tham gia của ATP, NADPH2 vă CO2. Sản phẩm đầu tiín của pha tối quang hợp lă tổng hợp nín glucose (C6H12O6). Có 3 con đường tổng hợp glucose từ CO2 ứng với 3 nhóm thực vật khâc nhau lă thực vật C3, thực vật C4 vă thực vật CAM (Crasulacean Acid Metabolism), được thực hiện theo câc chu trình C3, C4, CAM.
VIII. Tia tử ngoại vă câc hiệu ứng sinh học của nó
1. Tia tử ngoại vă hiệu ứng tâc dụng của nó ở mức độ tế băo
Trong thiín nhiín nguồn bức xạ tử ngoại lă mặt trời. Trín đường đi tới trâi đất, phần lớn năng lượng của tia cực tím bị tầng Ozôn hấp thụ vă chỉ còn lại phần ânh sâng có bước sóng từ 200nm đến 400nm (nanômĩt) tâc dụng lín cơ thể sinh vật. Tia tử ngoại thường
được chia ra 3 vùng chính sau:
- Vùng cực tím sóng dăi có λ = 320nm đến 400nm - Vùng cực tím sóng trung có λ = 280nm đến 320nm - Vùng cực tím sóng ngắn có λ = 200nm đến 280nm
Khâc với tia gamma (γ) vă tia Roentgen (X), tia tử ngoại vùng 200nm đến 400nm không có khả năng gđy ra quâ trình ion hóa câc phđn tử sinh học. Tia tử ngoại chỉ gđy ra hiện tượng kích thích lăm cho điện tử của câc phđn tử sinh học từ mức cơ bản chuyển lín mức kích thích có năng lượng cao hơn, tức lă đê hoạt hóa câc phđn tửđó. Do vậy, câc phđn tử
sinh học đê được hoạt hóa, chúng dễ dăng tham gia văo câc phản ứng hóa sinh dẫn tới gđy kích thích hoặc lăm tổn thương cơ thể sinh vật. Mặt khâc, khả năng xuyín sđu của tia tử ngoại kĩm, chỉ văi milimĩt, do đó nó chỉ gđy nín câc hiệu ứng sinh học ở lớp tế băo ngoăi cùng.
Tia tử ngoại có tâc dụng lăm xạm da, gđy phât ban đỏ hoặc gđy bỏng da. Tia cực tím sóng trung kích thích sự tổng hợp vitamin D có tâc dụng chống còi xương... Tia cực tím sóng ngắn có tâc dụng lăm thay đổi cấu trúc đặc trưng của lipit vă protein, có tâc dụng diệt khuẩn. Hầu hết câc công trình nghiín cứu trín câc đối tượng như vi khuẩn, vi sinh vật, tế băo thực vật vă động vật, đều phât hiện qui luật chung lă khả năng gđy ra tử vong nhiều, khi chiếu tia tử ngoại có bước sóng nhỏ hơn 300nm vă tử vong nhiều nhất ở bước sóng 260nm. Điều năy có liín quan tới sự tổn thương của phđn tử ADN vì nó hấp thụ cực
đại ở bước sóng 260nm. Tia tử ngoại còn gđy ra hiệu ứng ức chế sự phđn băo hoặc kích thích sự phđn chia tế băo tùy thuộc văo bước sóng ânh sâng chiếu. Ví dụ như Coviadin khi chiếu tia tử ngoại có bước sóng 256nm lín câc tế băo nấm men đê gđy ra sự ức chế