3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.3.Phương pháp thu thập và phân lập mẫu bệnh
* Phương pháp thu thập mẫu bệnh
Các phương pháp ựiều tra và lấy mẫu phải tuân thủ theo ựúng tiêu chuẩn BVTV Việt Nam [2]. Thu mẫu từ những vết bệnh có triệu chứng ban ựầu ựến những vết bệnh ựã có những triệu chứng thuần thục trên các giống ớt tại Hải Dương.
* Phương pháp phân lập mẫu bệnh
- Rửa sạch mẫu cây bằng nước máỵ Sau khi rửa sạch có thể nhìn thấy rõ những triệu chứng ựiển hình của vết bệnh, cắt những mẩu có vết bệnh dài khoảng 1- 3cm (mẩu này gồm cả phần tế bào khoẻ và cả phần tế bào bị bệnh). Nhúng các mẩu vào dung dịch cồn 70o ựể khử trùng bề mặt trong khoảng 30 giây, sau ựó chuyển sang rửa lại bằng nước cất vô trùng, ựể lên giấy thấm sạch và thấm khô. Cắt những mẩu nhỏ là những phần gianh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ, cấy những mẩu này vào môi trường phân lập ựặc hiệu cho nấm thán thư.
* Kỹ thuật cấy nấm
- Các dụng cụ (dao, thớt, panh, que cấy) khử trùng dưới ựèn cồn ựược dùng ựể cấy các mô bệnh lên môi trường WA, mỗi ựĩa cấy 3 ựiểm.
- Sau khi cấy xong ựể các ựĩa trong phòng sạch dưới ựiều kiện ánh sáng 12h chiếu sáng và nhiệt ựộ khoảng từ 25 - 30oC.
- Khi tản nấm mọc có ựường kắnh bằng 1-2cm thì tiến hành cấy chuyển sang môi trường khác ựể giám ựịnh tên nấm gây bệnh. Môi trường cấy chuyển ựược ựể dưới ựiều kiện nhiệt ựộ và ánh sáng thắch hợp. Tiến hành cấy chuyển
nấm sang môi trường PGA cho tới khi thu ựược nấm thuần. Sử dụng nấm thuần ựể nghiên cứu các ựặc ựiểm hình thái học, sinh học và khảo sát hiệu lực thuốc trừ nấm trong phòng thắ nghiệm.
* Phương pháp cấy ựơn bào tử
Phương pháp cấy ựơn bào tử ựược dùng ựể tách riêng từng nấm trong môi trường phân lập từ mô cây bệnh :
- Khêu bào tử ổ bào tử bằng que cấy nấm (không lấy quá nhiều bào tử). - Hoà bào tử vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng.
- Lắc ựều tay ựể bào tử phân chia ựều trong ống nghiệm.
- đổ dung dịch vào ựĩa môi trường WA (ựược ựổ ắt nhất trước khi cấy 1 tuần) và lắc nhẹ cho dịch dàn ựều trên toàn bộ bề mặt môi trường.
- Quan sát ựĩa môi trường dưới kắnh lúp soi nổi ựể tìm bào tử nảy mầm. - Dùng que cấy nấm dẹt, sắc cắt xung quanh bào tử (cắt toàn bộ phần môi trường phắa dưới của bào tử) và chuyển miếng môi trường có bào tử trên ựó sang môi trường mớị