Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA- Tắnh ựa hình các ựoạn ADN ựược nhân bản ngẫu nhiên)
Chỉ thị RAPD là sự khuếch ựại ngẫu nhiên các ựoạn ADN genome với những mồi ựơn (6-10 nu) (Williams và cs., 1990). Trong phản ứng này, một mồi ựơn gắn vào ADN genome ở hai vị trắ khác nhau trên sợi bổ trợ của ADN khuôn. Sự ựa hình phát hiện ựược khi sử dụng kỹ thuật RAPD có thể là do sự thay ựổi bazơ nucleotit ở vị trắ gắn mồi, hoặc sự thêm hay mất nucleotit nằm trong vùng khuếch ựại (Williams và cs., 1990; Parks và cs., 1991). Do ựó, ựa hình RAPD thường là trội, biểu hiện sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm khuếch ựại từ một locus ựơn. Ưu ựiểm chắnh của chỉ thị này là không ựòi hỏi thông tin về trình tự ADN; kỹ thuật ựơn giản, rẻ và nhiều chỉ thị có thể ựược phân tắch trong một thời gian ngắn. Do vậy, kỹ thuật này ựược sử dụng rộng rãi trong việc lập bản ựồ di truyền, phân tắch và xác ựịnh mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể ựể phục vụ trong công tác lai tạo hoặc phân loại. chỉ thị RAPD cũng ựược sử dụng như những chỉ thị phân tử ựể xác ựịnh những gen kiểm soát hoặc có liên quan ựến một tắnh trạng nào ựó ở cây trồng, vắ dụ như tắnh trạng chất lượng sợi ở cây bông, tắnh trạng kháng virus ở cà chua (Tatineni và cs., 1996; Winter và cs., 1995). Nhược ựiểm của chỉ thị này thường là các chỉ thị trội cho nên khi các sản phẩm ựược khuếch ựại có kiểu gen dị hợp tử thì không thể phân biệt ựược và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 25 do ựó RAPD không có ưu ựiểm như RFLP là chỉ thị ựồng trội [43]. Ngoài ra,
ựộ nhạy và ựộ tin cậy của RAPD còn phụ thuộc vào ựiều kiện phản ứng.
Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism- đa hình chiều dài các ựoạn ADN ựược nhân bản chọn lọc)
Phương pháp AFLP là sự kết hợp việc sử dụng enzym giới hạn với khuếch ựại PCR và phát hiện ựa hình, ựược phát minh bởi Zabeau và Vos (1993). Nguyên tắc của kỹ thuật: ADN genome ựược cắt ựồng thời với hai loại enzym khác nhau (vắ dụ MseI và EcoRI) thành các ựoạn có kắch thước không giống nhau, trong số ựó sẽ có một số phân ựoạn mang các ựầu mút giống nhau. Nếu như ta sử dụng một ựoạn nối (adaptor) như nhau có gắn thêm một hoặc một số oligonucleotit ựược chọn lọc trước ựể ựịnh hướng cho việc gắn của các cặp mồi PCR thì tất cả những ựoạn ADN có ựầu mút giống nhau sẽ ựược nhân bản. Khi thay ựổi số lượng và trình tự các oligonucleotit ựược chọn lọc ở các ựầu nối ta có thể nhận ựược những ựoạn ADN ựược nhân bản khác nhau. Kỹ thuật này ựược ựánh giá là nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác ựịnh tắnh ựa dạng ở cây trồng (Redona và cs., 1998; He và cs., 1997), tách dòng và lập bản ựồ phân tử (Yong và cs., 1996). Tuy nhiên, ựa hình AFLP là do sự có mặt hay vắng mặt của vị trắ gắn mồi, là chỉ thị có bản chất trội, nên nó không có lợi khi dùng ựể lập bản ựồ các quần thể phân ly [10], [43], [63].
Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats - Sự lặp lại của trình tự ựơn giản)
Genome của cả ựộng và thực vật ựều có chứa một số lượng lớn các trình tự ựơn giản ựược lặp lại, còn gọi là các vi vệ tinh (microsatellites), dài khoảng 1-5bp ựược lặp lại nhiều lần. Ở thực vật, trình tự AT/TA ựược nhắc lại nhiều nhất, sau ựó là GA/CT, trong khi ựó thì trình tự CA/GT lại phổ biến ở ựộng vật (Zhao và Ganal, 1996). Chúng ựược sử dụng như những chỉ thị ADN trong lập bản ựồ di truyền. Microsatellites là phương pháp tốt nhất ựể
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 26 nghiên cứu ADN fingerprinting bởi vì sự ựa hình ở mức ựộ cao của chúng
(Saghai, Maroof và cs.., 1994) và là chỉ thị ựồng trội (Rongwen và cs.., 1995). Chỉ thị microsatellites có thể phân tắch bằng PCR nên kỹ thuật này chỉ cần một lượng nhỏ ADN mẫu và không tốn kém. đến nay, hơn 300 cặp mồi SSR của lúa ựã ựược phổ biến [10], [43].
Chỉ thị SSR là chỉ thị ADN quan trọng và ựược sử dụng phổ biến trong nghiên cứu ựa dạng di truyền, lập bản ựồ gen, nhận dạng di truyền, chọn giống phân tử ở lúa (Lưu Thị Ngọc Huyền, 2001; Phạm Thị Thúy, 2006), ngô (Ngô Thị Minh Tâm, 2007), ựỗ tương (Lương Thị thu Hương, 2006) [7], [28]. Chỉ thị SSR có hai ưu ựiểm lớn so với các chỉ thị ADN khác:
- Tắnh ựặc hiệu cao: các ựoạn mồi SSR ựược thiết kế dựa trên vùng trình tự sườn có tắnh bảo thủ cao của các ựoạn lặp SSR, do ựó sản phẩm nhân gen của phản ứng SSR-PCR ựặc hiệu và ổn ựịnh hơn các chỉ thị ADN ngẫu nhiên.
Bên cạnh ựó, nhờ tắnh chất bảo thủ của vùng trình tự sườn mà các mồi SSR có thể ựược sử dụng chéo giữa các loài có quan hệ di truyền gần gũi [51], [7].
- Di truyền ựồng trội và mức ựộ ựa hình cao: Trải qua tiến hóa và các biến ựổi di truyền, số lần lặp lại các motif SSR thay ựổi rất nhiều và làm cho các ựoạn SSR có chiều dài khác nhau. Bởi vậy, phản ứng PCR có thể phát hiện các alen khác nhau trong một locus SSR, qua ựó phát hiện ựược các cá thể ựồng hợp tử/dị hợp tử ở locus ựó (chỉ thị ựồng trội).
Ngoài hai ưu ựiểm trên, với tần suất xuất hiện trên hệ gen cao của các trình tự lặp thì số lượng chỉ thị SSR là rất phong phú với mức ựộ ựa hình cao. Dựa trên kỹ thuật PCR và kết hợp với các phương pháp phát hiện khác nhau, các phân tắch sử dụng chỉ thị SSR rất ựơn giản, nhanh chóng, tin cậy và ựặc biệt có khả năng tự ựộng hóa cao [77], [28], [40], [56], [62], ựiều này rất phù
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 27 hợp với các nghiên cứu di truyền quần thể như ựánh giá ựa dạng di truyền, lập
bản ựồ gen, chọn giống phân tửẦ Một số nghiên cứu so sánh, ựánh giá ưu nhược ựiểm của chỉ thị SSR với các loại chỉ thị khác như RFLP, AFLP, RAPD... ựã khẳng ựịnh những ưu ựiểm của SSR so với các chỉ thị trên [47], [25], [29].
Nhiều nỗ lực phát triển chỉ thị SSR genome của bông ựã ựược tiến hành và chỉ thị SSR ựang ựược sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu lập bản ựồ di truyền cây bông [49], [44], [23], [54], [66], [46].
Hàng nghìn chỉ thị SSR của bông ựã ựược xác ựịnh tại các phòng thắ nghiệm khác nhau: Brookhaven National Laboratory (BNL), Texas A và M University [44], [36], [66], [46].
Nghiên cứu gần ựây nhất của Wangzhen Guo và cs. ựã sử dụng chỉ thị SSR ựịnh vị ựược 1790 locus ở 26 nhóm liên kết bao phủ một vùng 3425,8 cM với khoảng cách trung bình giữa các locus là 1,91cM. Trong ựó, bản ựồ liên kết genome này bao gồm 71,96% các locus gen chức năng, 475 locus có liên kết với ba loại gen chắnh quy ựịnh quá trình sinh học, thành phần tế bào, chức năng phân tử ở bông [66].