a. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
ADN lá bông ựược tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB của Doyle J.J., và cs. (1987) có cải tiến [22] [Phụ lục 2].
Kiểm tra ADN tổng số: Chất lượng và nồng ựộ ADN tổng số ựược kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Nồng ựộ chắnh xác ựược ựo trên máy quang phổ nanodrop.
b, Kỹ thuật SSR
Phản ứng PCR ựược tiến hành trên máy chu kỳ nhiệt (Mastercycler Eppendorf AG 22331). Tổng dung dịch phản ứng là 15 ộl bao gồm 50ng ADN tổng số, 0,15ộM mồi, 0,2 mM dNTPs, 1X dịch ựệm PCR, 2,5mM MgCl2 và 0,5 ựơn vị Taq TaKaRa. điều kiện phản ứng PCR ( bảng 3.3).
Bảng 3.3. Chương trình chạy phản ứng PCR
Các bước Nhiệt ựộ (0C) Thời gian Số chu kỳ Tác dụng
1 95 7 phút 1 Biến tắnh 2 94 55 72 15 giây 30 giây 2 phút 40 Biến tắnh Gắn mồi Tổng hợp 3 72 7 phút 1 Tổng hợp 4 4 Bảo quản
Phương pháp ựiện di trên gel agarose : theo phương pháp của Khoa Genome thực vật, Trường đại học công nghệ Texas, Mỹ (2002) có cải tiến ( phụ lục 3)
3.3.2. Phương pháp ựánh giá các ựặc tắnh nông sinh học của 21 giống bông bố mẹ
Thắ nghiệm bố trắ kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD với 3 lần nhắc lại. Các giống bông ựược gieo trồng và theo dõi theo các chỉ tiêu, quy trình chung của ngành bông:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 37 - Diện tắch ô thắ nghiệm: 6m2/1giống.
- Diện tắch bảo vệ, phân cách: 100m2 - Tổng diện tắch thắ nghiệm: 300m2
L591 L1358 L1426 L1458 L1488 L1490 L1503 L1516 L1530 L1562 L1598 NL1 L1490 L1503 L1516 L1530 L1562 L1598 L591 L1358 L1426 L1458 L1488 NL2 L1530 L1562 L1598 L591 L1358 L1426 L1458 L1488 L1490 L1503 L1516 NL3
Hình 3.1. Sơ ựồ thắ nghiệm ựánh giá 11 giống bông luồi
Hđ10 Hđ 62 Hđ 128 Hđ 129 Hđ 138 Hđ 139 Hđ 141 Hđ 147 Hđ 148 Hđ 156 NL1 Hđ 128 Hđ 129 Hđ 138 Hđ 139 Hđ 141 Hđ 147 Hđ 148 Hđ 156 Hđ10 Hđ 62 NL2 Hđ 141 Hđ 147 Hđ 148 Hđ 156 Hđ10 Hđ 62 Hđ 128 Hđ 129 Hđ 138 Hđ 139 NL3
Hình 3.2. Sơ ựồ thắ nghiệm ựánh giá 10 giống bông hải ựảo