IV. Phương phâp chẩn đoân bệ nh
4. Phương phâp tạo phản ứng chuỗi nhờ polymerase (PCR)
Nguyín tắc của phương phâp PCR
Tất cả câc ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyín biệt. Mồi lă những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, vă ADN polymerase sẽ nối dăi mồi để hình thănh mạch mới. Phương phâp PCR đê được hình thănh dựa văo đặc tính đó của câc ADN polymerase. Nếu cung cấp hai mồi chuyín biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn ADN nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa lă để khuếch đại một trình tự ADN xâc định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tựđó đủđể tạo câc mồi bổ sung chuyín biệt.
Câc hạn chế của phương phâp PCR
Do độ nhạy rất cao của phương phâp PCR đồng thời với thao tâc rất đơn giản, người ta có khuynh hướng sử dụng phương phâp năy để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiín, ta không thể quín rằng phương phâp có nhiều mặt hạn chế vă đòi hỏi sự thận trọng, đặc biệt khi tiến hănh thí nghiệm cũng như khi phđn tích kết quả. Có thể kể đến ba vấn đề lớn khi sử dụng phương phâp PCR:
- Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại lă giới hạn
đầu tiín: trừ văi trường hợp rất câ biệt, phương phâp PCR không hoạt động được với những đoạn ADN lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với câc độ dăi dưới 1.5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dăi lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xâc định qua thực nghiệm.
- Sự ngoại nhiễm: lă vấn đề lớn nhất đặt ra đối với phương phâp PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương phâp năy. Đđy lă vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoân, dự phòng vì hậu quả có thể rất nghiím trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường lă câc sản
phẩm khuếch đại của những lần thao tâc trước. Người ta đê chứng minh được rằng việc mở nắp câc ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ khiến cho câc phđn tử đê được khuếch đại thoât ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí vă bâm văo tường, cửa, thiết bị, dụng cụ... rồi nhiễm văo câc phản ứng tiến hănh sau đó.
- Câc sai sót gđy ra do taq polymerase: sự sao chĩp bởi taq polymerase cho tỉ lệ sai khâ cao (10-4, nghĩa lă cứ 10.000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính năy không nghiím trọng nếu ta chỉ cần xem xĩt kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại. Nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xâc định chính xâc trình tự nucleotic của ADN ta không thể loại bỏ hoăn toăn câc sai sót năy mă chỉ có thể giảm bớt; ví dụ nhưđảm bảo sự cđn bằng nồng độ câc nucleotic trong phản ứng, xâc định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tâc riíng biệt, so sânh trước khi đi đến trình tự chính thức, vv.
Tăi liệu tham khảo
1. Hảo, N.V., 2000. Một số vấn đề về kỹ thuật nuôi tôm sú công nghiệp. Nhă xuất bản nông nghiệp TPHCM
2. Lightner, D.V. 1996. (Ed.), A handbook of shrimp pathology and diagnostic. Procedures for disease of cultured Penaeid shrimp. World Aquaculture Society, Baton Rouge, LA, USA.
3. Manual of diagnostic Tests for Aquatic Animals, 2003. http://www.oie.int 4. Nho, N.T., N.A. Tuấn, T.K. Thường, 1994. Hướng dẫn kỹ thuật nuôi tôm sú. 5. Quản lý sức khỏe ao nuôi tôm. Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ dịch. 2002 6. Sindermann C.J. and D.V. Lightner. 1988. Disease Diagnosis and Control in
North American Aquaculture. Elservier Scientific Publisher. 431p.
7. Tower, K.J. and A. Cockayne (1993). Molecular Method for Microbial Identification and Typing. Chapman & Hall, London.
CHƯƠNG IX: BỆNH VIRUS
Bệnh virus xuất hiện nhiều vă gđy thiệt hại nghiím trọng cho nghề nuôi tôm ở Chđu  lă bệnh đầu văng vă bệnh đốm trắng. Năm 1986, bệnh đầu văng đê gđy thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm ở Đăi loan, Indonesia, Malaysia vă Philippines. Năm 1990 bệnh đầu văng xuất hiện ở Thâi lan vă bộc phât mạnh văo năm 1995 gđy tổn thất cho nghề nuôi tôm gần 40 triệu USD. Bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiín ở Trung Quốc vă Nhật Bản văo năm 1992, 1993. Cho đến nay bệnh năy được xem lă bệnh nguy hiểm nhất, gđy hậu quả nghiím trọng đến nghề nuôi tôm ở Chđu Â.
Mỗi loăi virus thường gđy bệnh cho ít nhất một loăi, thường lă văi loăi tôm nuôi, vă mức độ nhiễm bệnh cũng khâc nhau tùy loăi vật chủ. Mầm bệnh virus có thể tồn tại dưới dạng thể ẩn trong tất cả câc giai đoạn phât triển của vật chủ tuy nhiín chúng chỉ gđy bệnh vă gđy chết vật chủ ởđiều kiện thuận lợi. Mầm bệnh virus có thể lđy lan từ loăi năy sang một văi loăi khâc vă có liín quan trực tiếp đến câc điều kiện gđy sốc như mật độ cao, sự biến đổi đột ngột về nhiệt độ hay độ mặn. Nhập vă chuyển giống từ nơi năy đến nơi khâc cũng lă một trong những nguyín nhđn lđy truyền bệnh. Hiện nay chưa có câch trị bệnh virus hiệu quả nín việc âp dụng câc biện phâp phòng bệnh như chọn tôm giống sạch bệnh, xử lý nước cấp vă nước thải trong quâ trình nuôi vă quản lý tốt môi trường nuôi lă rất cần thiết.