NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.9 Phương pháp xác ñị nh serotype của các chủng Salmonella
Xác ñịnh serotype của các chủng Salmonella phân lập ñược tiến hành trên cơ sở kháng nguyên O kết hợp pha 1, pha 2 kháng nguyên H bằng phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh theo hệ thống phân loại White- Kauffmann-Le Minor ñược mô tả bởi Patrick và Francois-Xavier Weill (2007). Các bước chính thực hiện thí nghiệm ñược mô tả tóm tắt theo các trình tự dưới ñây.
+ Loại bỏ những vi khuẩn tự ngưng kết: Bằng phương pháp kiểm tra trên phiến kính với nước muối sinh lý 0,85% NaCl. Nếu có hiện tượng ngưng
kết thì loại bỏ, nếu huyễn dịch ñục ñều sẽ tiến hành giám ñịnh theo các bước tiếp sau.
+ Kiểm tra kháng nguyên O ña giá của vi khuẩn Salmonella: Các bước
tiến hành giống như phương pháp kiểm tra loại bỏ các chủng vi khuẩn tự ngưng kết chỉ khác là dùng kháng huyết thanh O ña giá thay cho nước muối sinh lý. Các chủng kiểm tra dương tính với kháng huyết thanh O ña giá thì tiếp tục xác ñịnh kháng nguyên O ñơn giá và kháng nguyên H.
+ Xác ñịnh kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella bằng kháng huyết thanh ñơn giá nhóm O: Căn cứ vào kết quả xác ñịnh nhóm kháng nguyên O ña
giá, tiến hành xác ñịnh kháng nguyên O ñơn giá bằng kháng huyết thanh ñơn giá nhóm O, theo quy trình và ñánh giá kết quả giống ở phần trên.
+ Xác ñịnh serotype kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella:
- Xác ñịnh kháng nguyên H, pha 1:
Cấy chủng vi khuẩn Salmonella cần giám ñịnh vào môi trường BHI, ủ ấm ở nhiệt ñộ 37oC trong 24giờ. Sau ñó bổ sung một lượng tương ñương dung dịch Saline (dung dịch nước muối sinh lý bổ sung 1% formol), ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 2giờ. Sử dụng canh trùng trên ñể xác ñịnh kháng nguyên H pha 1, theo phương pháp tiến hành trong ống nghiệm: Chuyển vào mỗi type (type chuyên ñể làm phản ứng ngưng kết) 50 µl kháng huyết thanh và 450 µl canh trùng ñã chuẩn bị như trên, lắc nhẹ, ñem giữ ở Waterbath ở 50oC trong vòng 1 giờ, rồi ñọc kết quả. Phản ứng dương tính khi kháng huyết thanh và kháng nguyên kết hợp với nhau tạo nên kết tủa như cụm bông ở ñáy ống nghiệm. Phản ứng âm tính khi không thấy có kết tủa.
Các chủng dương tính với pha 1 ñược sử dụng tiến hành phản ứng Induction: Chuẩn bị môi trường BHI (có 0,25% agar) ñựng trong type nhỏ có nút vặn, trong type cho sẵn 1 ống thuỷ tinh nhỏ hở 2 ñầu. Sau khi hấp vô trùng,
giữ ở 50oC rồi cho kháng huyết thanh chuẩn Salmonella (Salmonella H sera for phase induction) vào type thí nghiệm, ñể ở nhiệt ñộ phòng. Cấy vi khuẩn cần kiểm tra trích sâu theo ống, ủ ấm ở nhiệt ñộ 37oC trong 24 h, sau ñó kiểm tra kết quả. Phản ứng dương tính khi vi khuẩn mọc chồi lên mặt thạch, thạch trong ống bị ñẩy lên cao hơn trong type. Phản ứng âm tính: chỉ thấy vi khuẩn mọc theo ñường cấy trích sâu, thạch trong ống không bị ñẩy lên.
- Xác ñịnh kháng nguyên H, pha 2
Chỉ những chủng Salmonella dương tính với phản ứng Induction mới làm tiếp pha 2. Cấy chuyển chủng dương tính với phản ứng Induction vào ống canh thang BHI (5ml/type), ñể nghiêng trong tủ ấm trong vòng 6 giờ. Thêm vào ñó một lượng tương ứng dung dịch Saline ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 2 giờ. Sử dụng kháng huyết thanh H dùng cho pha 2, tiến hành phản ứng và ñọc kết quả giống như pha 1.
Căn cứ vào kết quả giám ñịnh ñặc tính sinh hóa và kết quả giám ñịnh huyết thanh, dựa vào hệ thống phân loại White-Kauffmann-Le Minor ñược mô tả bởi Patrick và Francois-Xavier Weill (2007) ñể xác ñinh serotype
Salmonella.