NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3 Xác ñị nh tổng số vi khuẩn hiếu khí, số lượng E.coli và Salmonella
trong 1g phân
Số lượng vi khuẩn hiếu khí, số lượng vi khuẩn E.coli và Salmonella
ñược xác ñịnh theo kỹ thuật ñếm số khuẩn lạc theo phương pháp mô tả bởi Quinn và cs (1994), trình bày tại phụ lục 4. Tóm tắt như sau: mẫu kiểm tra
ñược pha loãng với dung dịch ñệm pepton theo tỷ lệ 1/9 ñể ñạt ñược các bậc pha loãng thập phân khác nhau (10-1, 10-2…10-n). Mỗi mẫu kiểm tra phải nuôi cấy ít nhất 3 bậc pha loãng liên tiếp, mỗi bậc pha loãng nuôi cấy 2 ñĩa petri, trên các môi trường ñặc hiệu cho phép nhận dạng ban ñầu với vi khuẩn cần kiểm tra. Nuôi cấy hiếu khí ở nhiệt ñộ 370C ñể xác ñịnh tổng số vi khuẩn hiếu khí, ñọc kết quả sau 24 – 48 h. Nâng nhiệt ñộ nuôi cấy lên 420C ñể xác ñịnh số lượng E.coli và Salmonella.
ðể xác ñịnh số lượng vi khuẩn E.coli, mẫu kiểm tra ñược nuôi cấy trên môi trường thạch MacC. Những khuẩn lạc có kích thước lớn (1mm – 3mm), tròn, mặt khô, màu hồng cánh sen ñều ñược xem xét là khuẩn lạc E.coli.
Chọn 5 khuẩn lạc ñiển hình ñể giám ñịnh các tính chất sinh hóa và xác ñịnh tỷ lệ rồi tính kết quả theo tỷ lệ xác ñịnh.
ðể xác ñịnh số lượng vi khuẩn Salmonella, mẫu phân sau khi pha loãng ñược ria cấy trên môi trường BGA. Căn cứ vào ñặc ñiểm phát triển của khuẩn lạc trên môi trường ñể xác ñịnh số lượng khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella.
Chọn 5 khuẩn lạc ñiển hình ñể kiểm tra ñặc tính sinh hóa, và xác ñịnh tỷ lệ rồi tính toán kết quả theo tỷ lệ ñã xác ñịnh.
Dãy phản ứng IMViC (Indole, Methyl Red, Voges Proskauer và Citrat) là những tính chất sinh hóa bắt buộc kiểm tra, làm cơ sở ñể phân biệt các thành viên của họ vi khuẩn ñường ruột. Trong ñó phản ứng Indole ñược coi là phản ứng nhạy cho phép phân biệt ban ñầu E.coli và Salmonella.
2.3.4 Xác ñịnh kháng nguyên pili của các chủng E.coli
Xác ñịnh kháng nguyên pili theo phương pháp ñồng ngưng kết (coagglutination test) mô tả bởi Murray (1987), trình bày theo sơ ñồ tại phụ lục 2, tóm tắt các bước theo trình tự trình bày dưới ñây.
+ Chuẩn bị kháng nguyên: Các chủng E.coli sau khi phân lập và giám ñịnh một số ñặc ñiểm sinh học ñược cấy truyền trên môi trường Trypticase
soy agar và bảo quản ở tủ lạnh âm (-700C). Các chủng trên ñược nuôi cấy trở lại trên môi trường Minca agar là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của kháng nguyên pili. Trên một số môi trường khác vi khuẩn mất khả năng sinh kháng nguyên này. Nuôi cấy hiếu khí ở nhiệt ñộ 370C sau 24 h ñược sử dụng làm kháng nguyên.
+ Chuẩn bị kháng thể: Kháng thể ñồng ngưng kết (coagglutination antisera) ñược chuẩn bị theo hướng dẫn của nơi cung cấp.
+ Chuẩn bị kháng nguyên chuẩn: Theo hướng dẫn của nơi cung cấp. + Tiến hành: Dùng phiến kính trong, sạch, sau khi ñã ngâm cồn ethanol 900, ñể khô, sấy ở nhiệt ñộ 1200C trong 30 phút. Chia phiến kính làm 2 phần: Nhỏ lên mỗi phần ñã chia một giọt nước sinh lý 0,85%. Dùng que cấy trích lấy 1 - 2 khuẩn lạc E.coli trên môi trường Minca agar, trộn ñều với nước sinh lý rồi nhỏ kháng thể kháng pili F5 hoặc F41, F6, F5 + F41 lên giọt kháng nguyên ñã chuẩn bị, phía ñối diện nhỏ một giọt nước sinh lý 0,85%. Thí nghiệm ñối chứng ñược tiến hành với kháng nguyên chuẩn và kháng thể chuẩn.
Phản ứng ñược coi là dương tính khi những giọt kháng nguyên và kháng thể chuẩn hình thành những ñám ngưng kết màu trắng nhạt và phản ứng âm tính khi các huyễn dịch ñục ñều, không có ngưng kết.