- gen điều hoà operator
G AATTC C T T A A
4.2- CÁC LOẠI NUCLEASE
4.2.1- Phõn loại
Cỏc nuclease cú khả năng phõn cắt phõn tử DNA hoặc RNA. Cú ba kiểu phõn loại cỏc nuclease sau:
1,- Dựa vào bản chất của cơ chất mà nú tỏc dụng, người ta chia nuclease làm hai loại:
- Deoxyribonuclease (DNase), cơ chất của nú là DNA
- Ribonuclease (RNase), cơ chất của nú là RNA
2,- Dựa theo kiểu liờn kết mà enzyme thủy phõn, người ta cũng chia ra làm hai loại:
- Nuclease "a": Thuỷ phõn đặc hiệu liờn kết phosphodiester giữa cacbon (C3’) và nhúm phosphate.
- Nuclease "b": Thuỷ phõn đặc hiệu liờn kết phosphoester giữa cacbon (C5’) và nhúm phosphate (Hỡnh 4-1).
3,- Dựa theo hoạt tớnh enzyme, người ta cũng chia ra làm hai loại exonuclease và endonuclease:
- Exonuclease: Cắt cỏc liờn kết phosphoester từ hai đầu của chuỗi poly- nucleotide và từ đú cắt dần từng nucleotide, chỳng đũi hỏi là phải cú nhúm OH (3’) hoặc OH (5’) tự do ở hai đầu chuỗi.
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’
- Endonuclease: Thường thuỷ phõn liờn kết phosphoester ở vị trớ bất kỳ bờn trong chuỗi và tạo ra cỏc oligonucleotide.
O O O O OH O O HO P Nuclease (a) Nuclease (b) 5’ 5’ 3’ 3’ 1’ 1’ O O P OH OH H H CH2 CH2
UUHỡnh 4-1: Phõn loại nuclease theo liờn kết bị cắt
4.2.2- Một số nuclease thường dựng và ứng dụng của nú
4.2.2.1- DNase I
Là một endonuclease cú khả năng phõn cắt phõn tử DNA sợi đơn hoặc sợi đụi sau cỏc bazơ pyrimidine để tạo hỗn hợp oligonucleotide cú nhúm phosphat ở đầu 5’. Khả năng phõn cắt sợi đơn hoặc sợi đụi trong phõn tử DNA phụ thuộc vào sự cú mặt của Mn+2 và Mg+2.
- Khi cú mặt của Mn+2, enzyme này tấn cụng vào sợi đụi tạo vết cắt đầu bằng hay đầu dớnh.
- Khi cú mặt của Mg+2, nú tấn cụng vào một sợi trờn phõn tử DNA một cỏch độc lập.
Cỏc DNase được sử dụng để loại DNA ra khỏi dịch chiết RNA nhằm làm tinh sạch RNA. Ngoài ra, người ta cũn dựng để tạo vết đứt ngay trờn phõn
tử DNA trong kỹ thuật đỏnh dấu hay phỏt hiện những gen đang hoạt động trờn nhiễm sắc chất, vỡ ở nồng độ thấp chỳng chỉ cắt ở những vị trớ siờu nhạy cảm như những gen mở, vựng vừa phiờn mó.
4.2.2.2- Nuclease S1
Là enzyme được tỏch từ nấm sợi Asp. oryzae, cú khả năng phõn huỷ DNA sợi đơn, DNA sợi đụi. Khụng cú khả năng phõn cắt phõn tử lai DNA- RNA.
Cỏc enzyme nuclease S1 được sử dụng nhằm cỏc mục đớch sau:
- Phõn tớch cấu trỳc của cỏc phõn tử lai DNA- RNA,
- Loại bỏ cỏc mạch đơn của đầu so le để tạo đầu bằng,
- Loại bỏ những cấu trỳc kẹp túc trong khi tạo cDNA.
4.2.2.3- Desoxyribonuclease III (Exonuclease III ) Enzyme này được tỏch từ vi khuẩn E. Coli.
Nú xỳc tỏc phản ứng phõn cắt cỏc trỡnh tự nucleotide từ đầu 3’−OH tự do của một theo hướng 3’ → 5’. Kết quả là tạo vựng mạch đơn dài trờn DNA sợi đụi, ngoài ra cũn cú hoạt tớnh 3’ −phosphate.
3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’
Enzyme này được ứng dụng để tạo cỏc cấu trỳc mạch đơn ở một số vựng trờn phõn tử DNA để sản xuất mẫu dũ đặc trưng cho từng mạch hoặc phối hợp với nuclease S1 tạo đột biến mất đoạn tại những vựng đặc biệt.
4.2.2.4- Enzyme ribonuclease( RNase A và RNase H)
RNase hiện điện ở mọi nơi, enzyme thương mại được trớch ly từ tụy bũ.
Đặc trưng cắt liờn kết phosphodiester ngay sau một bazơ pyrimidine như uracil và cytosine của RNA mạch đơn. RNase A bền nhiệt khụng mất hoạt tớnh ở 90°C trong một giờ.
Được ứng dụng để loại bỏ RNA cũn sút lại trong dịch chiết DNA hoặc loại bỏ cỏc vựng khụng bắt cặp của RNA trờn phõn tử lai DNA- RNA.
RNase H là enzyme xỳc tỏc loại bỏ RNA. Sau khi phiờn mó ngược để tiếp tục tổng hợp mạch thứ hai của cDNA hỡnh thành mạch DNA sợi đụi.
4.2.2.5- Enzyme phosphodiesterase
Là một loại nuclease cú trong nọc rắn, cơ chất tỏc dụng là DNA và RNA, tấn cụng từ đầu 3’ của chuỗi polynucleotide.