- gen điều hoà operator
G AATTC C T T A A
7.4- PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRèNH TỰ CỦA AXIT NUCLEIC
Khi nghiờn cứu về gen, việc xỏc định được vị trớ của gen trờn nhiễm sắc thể chưa cho phộp kết luận về bản chất của nú như gen đú tương ứng với gen gỡ, chức năng điều hũa hay mó húa cho protein nào. Nhờ việc giải trỡnh tự gen mà người ta đó giải quyết được những khú khăn trờn. Cú hai phương phỏp giải trỡnh gen đú là phương phỏp húa học của Maxam-Gilbert và phương phỏp enzyme của Sanger và cộng sự.
7.4.1- Phương phỏp húa học của Maxam-Gilbert
Vào năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiờn phỏt minh ra phương phỏp giải trỡnh tự gen bằng phương phỏp húa học. Nguyờn tắc của phương phỏp là dựa trờn phản ứng húa học thủy giải đặc hiệu, cỏc DNA khụng tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phõn đoạn cú kớch thước khỏc nhau.
Trước hết, phõn tử DNA được đỏnh dấu đồng vị phúng xạ P32ở đầu 5’ của mạch đơn, tạo những đoạn đỏnh dấu cú thể phỏt hiện bằng hỡnh phúng xạ. Xử lớ húa học đặc hiệu phõn hủy đặc trưng một loại nucleotide của mạch DNA đó đỏnh dấu phúng xạ, tạo cỏc đoạn oligonucleotide cú chiều dài hơn kộm nhau 1 nucleotide được phỏt hiện bằng điện di. Kết qủa cỏc phản ứng húa học xử lớ mạch DNA được phỏt hiện bằng điện di trờn gel polyacriamid cú thể xỏc định được trỡnh tự mạch đơn.
Mạch đơn đó đỏnh dấu phúng xạ cú thể xử lớ theo 4 nhúm phản ứng:
- Nhúm phản ứng thứ nhất xử lớ mạch đơn DNA bằng dimethyl sulphat làm đứt mạch tại G.
- Nhúm phản ứng thứ hai xử lớ mạch đơn DNA bằng axit (pH=2) gõy đứt mạch đơn tại A hoặc G.
- Nhúm phản ứng thứ ba xử lớ mạch đơn DNA bằng hydrazin gõy đứt mạch đơn tại T và C.
- Nhúm phản ứng thứ 4 xử lớ mạch đơn DNA bằng hydrazin với nồng độ muối cao làm đứt mạch đơn tại C.
Kết quả: Cỏc phản ứng tạo thành cỏc đoạn DNA cắt ngẫu nhiờn, cú kớch thước khỏc nhau. Điện di trờn gel polyacriamid (Hỡnh 7-5), đọc kết quả điện di bằng mỏy phúng xạ tự ghi ta thu được trỡnh tự nucleotide của mạch đơn DNA. G C ACACTG ACACT ACAC ACA AC A T+C G+A - +
Hỡnh 7-5: Sơđồ giải trỡnh gel theo phương phỏp hoỏ học
Vớ dụ, đoạn mạch đơn DNA đỏnh dấu phúng xạ P32, đầu 5` ở