- gen điều hoà operator
G AATTC C T T A A
5.5.3- CÁC VECTOR CHUYỂN GEN KHÁC
5.5.3.1- Cỏc cosmid
1,- Đặc tớnh cấu tạo: (Hỡnh 5-9)
Cỏc cosmid là những vector lai nhõn tạo từ một plasmid với cỏc trỡnh tự cos của phage λ (được sử dụng từ năm 1978). Cỏc trỡnh tự cos này điều khiển sự đúng gúi DNA tỏi tổ hợp vào đầu của phage. Khi bao gúi cỏc vựng cos đều bị cắt, chỉ cũn một phần DNA của cosmid được giới hạn bởi cỏc đầu dớnh với
đoạn cài DNA lạ được bao gúi. Trong phản ứng bao gúi in vitro, cỏc protein cần thiết cho sự tạo thành đầu và đuụi phải được thờm vào để cho cỏc phage cú thể tự hợp thành.
Cosmid là những plasmid cú cỏc vựng giới hạn mà tại đõy, người ta cú thể cài lắp DNA lạ và một gen chống chịu ampicilline. Kớch thước cosmid ≈ 5kb do đú, nú cú thể nhận được đoạn cài 35ữ45kb và cú thể tới 47kb (như chỳng ta đó thấy ở Mục 5.5.2.2, đầu của phage λ cú thể bao gúi được 52kb).
Vào thời điểm gõy nhiễm E. Coli, DNA tỏi tổ hợp được phúng vào vi khuẩn. Trong vi khuẩn cỏc đầu dớnh sẽ bắt cặp tạo ra cosmid tỏi tổ hợp khộp kớn dạng vũng và tỏi bản như một plasmid.
2,- Ưu điểm và ứng dụng của cosmid:
Cũng như phage, cosmid cho khả năng xõm nhiễm tế bào vi khuẩn lớn, nhận đoạn cài cú kớch thước lớn.
ApR Cos
Cosmid
Vùng cắt bằng RE để càiDnAngoại lai
5 kb
≈
Hỡnh 5-9: Cấu tạo cosmid
Trong tế bào chủ, nú tự nhõn bản như plasmid. Cho nờn người ta nhận được những khuẩn lạc, chứ khụng phải đĩa phõn giải trờn mặt thạch, thuận lợi cho việc quan sỏt.
Với những tiện lợi trờn, người ta dựng cosmid để tỏch dũng từ những gen lớn để tạo ngõn hàng genom (bộ gen). Những vi khuẩn mang vector này cú khả năng chống chịu với mụi trường cú ampiciline.
Tuy vậy việc ứng dụng cosmid để tỏch dũng cũng rất khú khăn và vất vả.
5.5.3.2- Cỏc nhiễm sắc thể nhõn tạo của nấm men YAC
(Yeart - Artificial - Chromosomes)
Do nhu cầu tạo dũng với những trỡnh tự DNA ngày càng lớn, cỏc nhà nghiờn cứu tỡm tũi phỏt triển những vector ngày càng mới. Ngày nay người ta đó tạo ra YAC cho phộp tạo dũng với những đoạn DNA dài 150ữ1.000kb, trung bỡnh là 350kb. Bằng nghiờn cứu cho thấy ở nấm men (Saccharomyces Cerevisiae), nhiễm sắc thể muốn nhõn đụi và phõn ly tốt cần ba trỡnh tự:
- 2 TEL (telomere): Trỡnh tự đầu cuối của NST
- CEN (centrmere - tõm động): Trỡnh tự trung tõm của NST, đảm bảo sự chia đụi và đi về 2 cực của tế bào
- ARS (autonomously replicating sequence): Trỡnh tự sao chộp tự chủ tương tự như ori ở plasmid
Dựa vào đú người ta đó cấu tạo NST nhõn tạo cú đủ ba trỡnh tự núi trờn với cấu tạo gồm 2 cỏnh tay, giữa 2 cỏnh tay người ta cú thể cài đặt một đoạn DNA cần tạo dũng với kớch thước khoảng 150 đến 1.000kb. Trờn mỗi cỏnh tay gồm cỏc gen đỏnh dấu di truyền để chọn lọc cỏc tế bào nấm men cú chứa YAC và cỏc chuỗi tận cựng cú chức năng telomer đoạn cuối của NST. Một trong hai cỏnh tay mang một mảnh DNA hoạt động như một tõm động và một nguồn tỏi bản ori. Việc cài DNA lạ vào gen mó húa chất ức chế tRNA vận chuyển tyrsine sẽ làm biến đổi màu sắc khuẩn lạc tế bào gốc cú mang gen hổ phỏch (khuẩn lạc từ trắng sang đỏ) khi cú mặt của DNA lạ. Đõy là dấu hiệu về sự hiện diện của YAC tỏi tổ hợp trong tế bào nấm men.
Cỏc nhiễm sắc thể này được đưa vào tế bào chủ (nấm men), nú được nhõn lờn như NST khỏc ở trong tế bào nấm men và ta cú được những gen mong muốn.
5.5.3.3-Cỏc nhiễm sắc thể nhõn tạo của động vật cú vỳ
1,- Cấu tạo: Tương tự như YAC và bao gồm:
- Trỡnh tự TEL
- Trỡnh tự CEN
- Trỡnh tự ARS
Nhưng khỏc với YAC là trỡnh tự TEL và CEN cú nguồn gốc từ người. Điều này cho phộp MAC (Mammalian Artificiel Chromosomes) vào tế bào động vật cú vỳ và giữ được ổn định trong tế bào.
2,- Mục đớch sử dụng:
Chủ yếu sử dụng nghiờn cứu cho cỏc tế bào bậc cao mà chỳng ta khụng sử dụng được với tế bào nấm men. Khi đưa NST vào tế bào chủ, nú cũng tồn tại được và nhõn lờn trong tế bào chủ.
5.5.4- Cỏc vector là virus của eucaryote
Là những vector từ virus và tế bào tiếp nhận vector này là tế bào eucaryote. Nú cú cấu tạo giống như phage λ. Tuy nhiờn cỏc loại vector này cú tớnh đặc hiệu cao và người ta xõy dựng dựa trờn những hiểu biết cụ thể.
CHƯƠNG VI CễNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP VÀ SỰ TÁCH DềNG