- gen điều hoà operator
P 32 ACACTG 32ACACT
Sau khi xử lớ bằng phương phỏp húa học và cắt mạch đơn núi trờn ta thu được cỏc phõn đoạn sau:
- Kết quả nhúm 1 cắt tại G: P32ACACT P32ACACTG
- Kết quả phản ứng nhúm 2 cắt tại A hoặc G: P32AC
P32ACACTG P32ACACT P32ACACT P32ACACTG
- Kết quả phản ứng nhúm 3 cắt tại C hoặc T: P32A P32ACA P32ACACTG P32ACAC P32ACACTG
- Kết quả phản ứng nhúm 4 cắt tại C: P32A P32ACA P32ACACTG
Tổng hợp cỏc kết quả, ta thu được trỡnh tự cỏc nucleotide trờn mạch đơn DNA, từ đú ta biết được trỡnh tự sắp xếp cỏc nucleotide của gen.
7.4.2- Phương phỏp enzyme sử dụng cỏc dideoxynucleotide
Phương phỏp này được F. Sanger và cộng sự phỏt minh vào năm 1977. Nguyờn tắc của phương phỏp dideoxy là dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trỡnh tự cần xỏc định nhờ hoạt động của enzyme DNA-polymerase. Với việc sử dụng thờm cỏc dideoxynucleotide (ddNTP) với cỏc deoxynucleotide (dNTP) thụng thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hỡnh thành một tập hợp nhiều đoạn DNA cú kớch thước khỏc nhau. Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi mạch đơn khoảng 20 nucleotide, bốn loại dNTP (trong đú cú một loại đỏnh dấu bằng đồng vị phúng xạ) và bổ xung thờm 1% ddATP (hoặc ddCTP, ddGTP, ddTTP) cho mỗi loại phản ứng. Cỏc ddNTP mất hai nguyờn tử oxy ở C3 và C2 khi mạch đơn DNA đang tổng hợp được gắn 1 ddNTP phản ứng ngừng tổng hợp. Mỗi loại phản ứng được thực hiện riờng rẽ, cú DNA khuụn, DNA mồi, đầy đủ cỏc loại dNTP, enzyme Taq DNA- polymerase, dung dịch đệm và cú thờm khoảng 1% một loại ddNTP. Kết quả phản ứng tổng hợp nờn cỏc đoạn oligonucleotide dài ngắn khỏc nhau một nucleotide và được nhận biết nhờ phương phỏp điện di (Hỡnh 7-6). Tổng hợp kờt quả phản ứng ở 4 ống, thu được trỡnh tự cỏc nucleotide của mạch đơn, cú thể biết được trỡnh tự sắp xếp cỏc nucleotide trong gen.
TTG TG TGA TGAG TGAGG TGAGGT TGAGGTC - +
Hỡnh 7-6: Sơđồ giải trỡnh gen theo phương phỏp Sanger
Vớ dụ: Giải trỡnh đoạn gen: 5`- AGTCCAG-3`
- Mạch cần tổng hợp là 3`- TCAGGTC-5`
- Kết quả phản ứng theo loại A: TCAdd
TCAGGTC
- Kết quả phản ứng loại G: TCAGdd
TCAGGdd TCAGGTC - Kết quả phản ứng loại C: TCdd TCAGGTCdd TCAGGTC - Kết quả phản ứng loại T: Tdd TCAGGTdd TCAGGTC
7.4.3- Phương phỏp xỏc định trỡnh tự nucleotide bằng mỏy tựđộng
Trong kĩ thuật này, người ta khụng đỏnh dấu bằng cỏc đồng vị phúng xạ mà bằng húa chất (cỏc fluochrome). Mỗi loại ddNTP được đỏnh dấu bằng một fluochrome cú màu khỏc nhau. Như vậy, tất cả cỏc oligonucleotide cựng chấm dứt tại một loại ddNTP sẽ cú cựng một màu. Sau khi điện di trờn gel polyacriamid, kết quả sẽ được xử lớ qua một hệ thống vi tớnh.