- gen điều hoà operator
6.5-NGÂN HÀNG cDNA
G AATTC C T T A A
6.5-NGÂN HÀNG cDNA
6.5.1- Thiết kế ngõn hàng cDNA
Ngõn hàng cDNA là tập hợp cỏc bản sao cDNA từ tất cả cỏc mDNA của một tế bào. Như vậy, ngõn hàng được thiết lập từ một loại tế bào xỏc định (tế bào biệt húa), vỡ thế, cDNA mang tớnh tế bào rất cao.
Quỏ trỡnh chuẩn bị ngõn hàng cDNA bao gồm cỏc bước sau đõy:
- Chiết tỏch RNA tổng số, ta phải chọn những tế bào cú chứa nhiều mRNA cần thiết và sau đú, làm sạch mRNA,
- Chọn lựa cỏc mRNA chứa nhiều A (polyA) bằng cỏch tỏch trờn cột xenlulose oligo dT,
- Tổng hợp cDNA sợi kộp đầu bằng từ mRNA dưới tỏc dụng của enzyme sao chộp ngược nhờ kỹ thuật nuclease S1 hoặc kỹ thuật Gubler-Hoffman,
- Metyl húa cỏc vựng hạn chế (cú trong đoạn cDNA sợi đụi) được nhận biết bởi enzyme EcoRI để bảo vệ vựng này khụng bị cắt khi thao tỏc với EcoRI,
- Tạo đầu dớnh bằng cỏch sử dụng đoạn nối linker cú chứa trỡnh tự nhận biết bởi EcoRI, sau đú, cắt bằng enzyme EcoRI. Trong trường hợp này, chỉ cú đoạn nối bị cắt cũn cDNA vẫn cũn nguyờn vẹn (do được metyl húa). Đưa cDNA vào vector tạo DNA tỏi tổ hợp,
- Ghộp cDNA đầu dớnh vào vector thớch hợp đó được mở EcoRI và đó khử nhúm phosphat,
- Hàn kớn mạch nhờ enzyme phosphoryl húa và enzyme ligase để tạo vector tỏi tổ hợp,
- Đưa vector tỏi tổ hợp vào tế bào chủ và nuụi cấy trong cỏc điều kiện thớch hợp để tạo dũng,
- Xỏc định dũng cần tỡm và thành lập ngõn hàng cDNA.
Mục đớch của việc thiết lập ngõn hàng cDNA là nhằm nghiờn cứu sự biểu hiện của một gen xỏc định cựng với những vấn đề liờn quan đến sự điều hũa biểu hiện gen cũng như mối tương tỏc giữa cỏc gen trong một quỏ trỡnh sống.
Chỳ ý: Khi phõn tớch kết quả thu được ngõn hàng cDNA, cần chỳ ý tỏc dụng sinh lớ từng thời điểm thớ nghiệm.
6.5.2- Sàng lọc ngõn hàng cDNA
Một phương phỏp phổ biến nhằm sàng lọc ngõn hàng cDNA được bắt đầu từ việc tạo canh trường nuụi cấy chứa đựng nhiều khuẩn lạc từ ngõn hàng cDNA. DNA plasmid từ mỗi mẻ cấy vi khuẩn gắn với mảnh nhỏ nitro- xenlulose (màng lai) sẽ bị biến tớnh và lai với mRNA tổng số. Mỗi mRNA khỏc nhau sẽ được lai trờn nitroxelulose với thứ tự cDNA bổ sung của nú. Cỏc mRNA bỏm vào màng lọc được tỏch ra và dựng để tổng hợp protein mà nú mó húa bằng hệ thống dịch mó invitro. Protein hỡnh thành được đem phõn tớch xem cú phải là sản phẩm của mRNA cần tỡm hay khụng, và từ đú, xỏc định vi sinh vật nuụi cấy chứa gen mong muốn. Sàng lọc tất cả cỏc mẻ nuụi cấy theo cỏch trờn để xỏc định dũng đơn thể hiện gen tỡm kiếm.
CHƯƠNG VII
MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU TRONG CễNG NGHỆ DI TRUYỀN