- gen điều hoà operator
7.1-CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT AXIT NUCLEIC
G AATTC C T T A A
7.1-CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT AXIT NUCLEIC
Mọi nghiờn cứu và ứng dụng của cụng nghệ gen đều được bắt đầu từ việc thu nhận một lượng axit nucleic tinh sạch. Mối quan tõn đầu tiờn của kỹ thuật tỏch chiết axit nucleic là thu nhận được cỏc phõn tử này ở trạng thỏi nguyờn vẹn, khụng bị phõn hủy bởi tỏc nhõn cơ học, tỏc nhõn húa học và enzyme như RNase, DNase.
7.1.1- Phương phỏp tỏch chiết DNA vi khuẩn
DNA cú kớch thước lớn, mọi việc chiết tỏch cần phải trỏnh mọi tỏc nhõn cơ học, hoỏ học tới phõn tử DNA này.
Việc tỏch DNA từ tế bào vi khuẩn được chia làm bốn bước cơ bản:
7.1.1.1- Nuụi cấy và thu sinh khối
Tựy từng loại vi khuẩn mà người nghiờn cứu chuẩn bị mụi trường và điều kiện nuụi cấy khỏc nhau như nhiệt độ, độ pH, và điều kiện dinh dưỡng thớch hợp cho sự phỏt triển của vi khuẩn.
Tỏch tế bào ra khỏi dịch nuụi cấy bằng cỏch ly tõm và làm sạch tế bào. Thụng thường khoảng 1.000ml dịch nuụi cấy li tõm và thu lấy khoảng 10ml cặn vi khuẩn.
7.1.1.2- Phỏ vỡ màng tế bào và giải phúng cỏc thành phần bờn trong
Axớt nucleic được giải phúng ra khỏi màng tế bào bằng phương phỏp húa học và sinh học để thu dịch chiết tế bào.
Enzyme lysozyme là một enzyme cú trong lũng trắng trứng hoặc phage T4, cú khả năng phỏ vỡ thành phần trựng hợp của thành tế bào. EDTA (TrilonB) tạo phức với Mg+2 dạng hũa tan và làm vỡ thành tế bào. Đồng thời EDTA ngăn khụng cho enzyme trong tế bào phõn hủy DNA. Người ta cũn cú
thể phỏ vỡ màng tế bào và giải phúng DNA ra khỏi liờn kết histon bằng chất tẩy rửa SDS (Sodium Derecyl Sylfat) hoặc enzyme protease.
Cỏc chất phỏ vỡ màng này làm li giải màng, tỏch rời cỏc phần tử lipit và gõy ra sự gẫy màng tế bào.
7.1.1.3- Làm sạch DNA từ dịch chiết tế bào
Loại bỏ cỏc thành phần khụng mong muốn như protein, lipit và cỏc thành phần khỏc bằng kết tủa phõn đoạn. Mẫu được lắc mạnh trong hệ dung mụi phenol-chloroform để biến tớnh, kết tủa protein và giải phúng axớt nucleic vào dung dịch lỏng. Protein bị biến tớnh sẽ tỏch ra khỏi pha nước cú chứa DNA sẽ được tỏch ra nhờ ly tõm. Dịch nổi gồm axit nucleic và nước được hỳt ra và tiếp tục phõn hủy RNA bằng enzyme RNase. Sau đú, tỏch DNA và nước để thực hiện bước phõn tớch tiếp theo.
7.1.1.4- Thu hồi DNA dạng đặc
Mục đớch của bước này là thu DNA dạng cụ đặc, nhằm bảo vệ chỳng khỏi sự phõn hủy của enzyme. Cú 2 phương phỏp kết tủa:
Kết tủa DNA trong etanol với sự cú mặt Na+ nồng độ cao, nhiệt độ thấp, tỷ lệ giữa etanol và mẫu phõn tớch là 3:1.
Kết tủa trong izopropanol, tỷ lệ giữa rượu và mẫu là 1:1. Với phương phỏp này khụng cần sự cú mặt của muối và loại được DNA cú phõn tử lượng thấp. Ly tõm cao tốc và thu nhận DNA dạng cụ đặc.
Trong cả hai phương phỏp, DNA thu được sẽ rửa trong etanol-70% để loại izopropanol và muối để thu được DNA tinh khiết.
7.1.2- Phương phỏp tỏch DNA plasmid
Việc tỏch DNA plasmid ra khỏi DNA nhiễm sắc thể là rất khú khăn. Tuy nhiờn người ta cú thể dựa vào sự khỏc nhau lý húa giữa hai loại DNA như: kớch thước, hỡnh thỏi, cấu trỳc của chỳng.
Về nguyờn tắc được tiến hành theo 3 bước sau:
7.1.2.1- Bước 1
Sau khi thu hồi và làm sạch cỏc tế bào cú chứa plasmid, người ta xử lý trong hỗn hợp SDS, EDTA hoặc NaOH làm DNA sợi đụi biến tớnh thành DNA sợi đơn nằm cạnh nhau.
7.1.2.2- Bước 2
Xử lý hỗn hợp trờn trong mụi trường đệm (NaCH3COO+CH3COOH) để kết tủa protein và SDS dạng tập hợp.
7.1.2.3- Bước 3
Đưa về mụi trường trung tớnh, DNA sợi đơn được hồi tớnh trở lại. Cũn DNA (NST) do dài nờn hồi tớnh chậm và kết tủa cựng SDS. Tỏch DNA plasmid bằng cỏch kết tủa trong etanol hoặc izopropanol, sau đú ly tõm tỏch được plasmid tinh sạch.
7.1.3- Tỏch DNA của tế bào khỏc
Ngoài vi khuẩn, DNA của virus, của tế bào thực võt, động vật cũng cú thể tiến hành tỏch để phục vụ cho cụng nghệ di truyền. Cỏc giai đoạn làm sạch tương tự như trờn. Chỉ cú giai đoạn nuụi cấy và phỏ vỡ màng tế bào thỡ khỏc, tuy nhiờn, tựy từng loại tế bào mà cú những cỏch xử lý sao cho thớch hợp.
7.1.4- Phương phỏp tỏch RNA tổng số và mRNA
7.1.4.1. Tỏch RNA tổng số
RNA được tiến hành chiết tỏch gồm cỏc bước cơ bản tương tự như DNA (bao gồm phỏ vỡ màng tế bào, loại protein, tủa RNA) nhưng ở đõy ta dựng enzyme desoxyribonuclease (DNase) để phõn huỷ DNA. Do RNA kộm bền và dể bị phõn huỷ bởi enzyme ribonuclease (RNase) cú nhiều ở khắp nơi, hoạt tớnh cao lại bền với nhiệt (trờn 90°C), vỡ vậy, điều kiện thao tỏc để chiết tỏch phải được tiến hành trong mụi trường vụ cựng nghiờm ngặt. Phương phỏp chung để tỏch RNA tổng số được tiến hành như sau:
Tế bào được nghiền với chất tẩy rửa SDS, sarcocyl nồng độ cao, nitơ lỏng để biến tớnh protein. Đồng thời mẫu cũng được nghiền với chất khử (2-
mercaptoethanol) để ức chế RNase. Nước sử dụng cũng được xử lý với DEPC (Diethylpyrocarbonat) cũng để loại bỏ RNase.
Cỏc protein, DNA được loại bỏ qua xử lý mẫu với hỗn hợp dung mụi Trizol (phenol pH=4, guanidinium thiocyanate, glycerol, sodium acetate), khi ly tõm, ta tỏch được RNA trong pha nước. DNA ở pH=4 bị hấp phụ vào pha dưới cựng với phenol, protein biến tớnh nằm giữa hai pha cũng bị loại cựng với DNA cựng với pha phenol. RNA trong pha nước được hỳt ra sau đú tủa bằng izopropanol để -20°C, li tõm và rửa lại bàng ethalnol 79%, thu hồi RNA tinh khiết, bảo quản lạnh để làm cỏc thớ nghiệm tiếp theo. Chất lượng của RNA tổng số được đỏnh giỏ sơ bộ qua điện di trờn gel agarose.
7.1.4.2. Tỏch từng loại RNA khỏc nhau
Dựa vào kớch thước trọng lượng phõn tử, người ta cú thể tiến hành sắc kớ, điện di hoặc ly tõm để tỏch từng loại RNA. Phương phỏp tỏch mRNA:
Do kớch thước bộ lại chiếm lượng nhỏ (1ữ5%) RNA tổng số, cú cấu trỳc đa dạng nờn khụng thể tỏch bằng phương phỏp trờn.
Nhờ đặc điểm mRNA cú đuụi polyA, do đú, người ta tỏch mRNA ra khỏi mẫu bằng phương phỏp sắc ký ỏi lực oligodt-xenlulose.
Ngày nay trờn thị trường cú loại viờn bi từ, trờn bề mặt cú gắn oligodt. Sau khi mRNA bỏm trờn bề mặt cỏc viờn bi từ, thụng qua liờn kết bổ sung với oligodt, cỏc viờn bi này thu nhận và đem ly tõm ta thu được mRNA tinh khiết.
Lưu ý rằng, để tỏch mRNA, người ta đi từ tế bào biệt hoỏ, lượng mRNA nhiều và đõy cũng là con đường nghiờn cứu cấu trỳc gen mó hoỏ. Ngày nay người ta đó tổng hợp được ngõn hàng mRNA.
7.1.5- Tỏch và thu nhận gen
Ngày nay, người ta cú thể thu nhận gen để thực hiện kỹ thuật di truyền bằng ba phương phỏp:
7.1.5.1- Tỏch cỏc đoạn DNA từ bộ gen
Đõy là phương phỏp sử dụng rộng rói ngay từ buổi đầu tiờn của sự phỏt triển kỹ thuật DNA tỏi tổ hợp. Toàn bộ phõn tử DNA của một sinh vật được cắt nhỏ thành những đoạn cú kớch thước 1,5ữ2kb bằng restriction enzyme
(RE). Điện di hoặc sắc kớ để tỏch đoạn DNA tinh khiết, sau đú gắn vào vector chuyển gen, tạo plasmid DNA tỏi tổ hợp.
Nhược điểm là tốn nhiều cụng sức và thời gian nhưng ngày nay người ta vẫn sử dụng để tạo ngõn hàng DNA bộ gen (genonic DNA libraries).
7.1.5.2- Sự tổng hợp gen bằng phương phỏp hoỏ học
Năm 1969, gen nhõn tạo đầu tiờn được tổng hợp do nhúm nghiờn cứu Khorama, đú là gen mó hoỏ tổng hợp tRNA vận chuyển amino axit (alamin) ở nấm men gồm 77 cặp nucleotide. Gen đầu tiờn khụng được biểu hiện vỡ khụng cú cỏc trỡnh tự điều hoà.
Về sau, chớnh nhúm này đó tổng hợp được gen cú hoạt tớnh: đú là gen mó húa cho chất ức chế tRNA vận chuyển tyrosine ở E. Coli, cú chiều dài khoảng 200 cặp nucleotide.
Vào năm 1977, K. Itakura và Boyer đó tổng hợp được gen mó húa sinh tổng hợp hormone somatostatin của động vật cú vỳ được biểu hiện ở E. Coli. và từ đú, nũi E. Coli mang gen tổng hợp húa học được tạo ra. Sau này, người ta tổng hợp húa học gen mó húa hormone tăng trưởng của người dàỡ 584pb.
Phương phỏp tổng hợp húa học gen cũng được sử dụng để tạo ra nũi vi khuẩn tổng hợp insulin, một loại hormone chữa bệnh tiểu đường cho người. Gen insuline được tổng hợp từ hơn 40 đoạn oligonucleotide khỏc nhau, sau đú, được nối lại nhờ enzyme lygase để tạo ra hai chuỗi polynucleotide dài 271 và 286bp mó húa, tổng polypeptide A cú 21 aminoaxit, polypeptide B cú 30 aminoaxit.
Qua cỏc kết quả thu được, cỏc nhà khoa học đó khẳng định rằng: muốn tổng hợp được gen bằng phương phỏp hoỏ học cần phải biết trỡnh tự của axit amin ở protein mà gen đú chịu trỏch nhiệm tổng hợp.
7.1.5.3- Sinh tổng hợp gen từ mRNA
Tổng hợp cDNA từ mRNA nhờ kỹ thuật của Gubler và Hoffman với sự cú mặt của enzyme phiờn mó ngược (Rever transcriptase - Hỡnh 7-1). Sau đú, cDNA (complementary) gắn vào plasmid và biến nạp vào vi khuẩn để tạo dũng cDNA. Phương phỏp này được trỡnh bày ở Chương 6 (thiết lập thư viện cDNA).
Ưu điểm là: Gen thu nhận bằng phương phỏp này đó loại bỏ được những trỡnh tự khụng mó hoỏ. Bằng con đường này, người ta đó tạo dũng gen mó hoỏ tổng hợp globine của người, động vật và chim, protein thủy tinh thể mắt bũ, ovalbumine (protein lũng trắng trứng) và fibroin tơ tằm.
Vào năm 1992 cỏc nhà khoa học Mỹ đó tạo được dũng cDNA của 2.375 gen của bộ nóo người. Phương phỏp tổng hợp gen từ mRNA ngày càng được phỏt triển, nú kết hợp với cỏc phương phỏp khỏc của sinh học phõn tử và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.
Enzyme - RT 5’ 3’ Cấu trúc kẹp tóc cDNA AAAA TTTT-mồi oligo-dT cDNA sợi kép m-RNA Nuclease S1 DNA -polymerase NaOH, R aseN Hỡnh 7-1: Sơđồ tổng hợp gen từ mRNA
7.2- PHƯƠNG PHÁP NHÂN BẢN (PCR - Polymerase Chain Reaction)
Phương phỏp tạo dũng invivo mà chỳng ta đó đề cập trong Chương 6 tuy đó giải quyết về vấn đề số lượng, nhưng đũi hỏi thao tỏc quỏ phức tạp và thời gian quỏ dài. Trong sự ra đời của cỏc phương phỏp khuếch đại (tỏi bản nhanh) invitro cú chọn lọc, chỳng ta phải kể đến phương phỏp PCR.
Phương phỏp PCR - phản ứng dõy chuyền nhờ hoạt động của enzyme DNA-polymerase - do K. Mulis cựng cộng sự phỏt minh năm 1985, đó đưa lại một cuộc cỏch mạng trong di truyền học phõn tử. Đõy là phương phỏp hoàn toàn mới trong việc nghiờn cứu, phõn tớch gen và hệ gen. Khú khăn lớn nhất trước đõy trong việc phõn tớch gen là ở chỗ chỳng là những mục tiờu đơn lẻ và
rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp khổng lồ. Kỹ thuật PCR ra đời đó thay đổi tất cả, giỳp chỳng ta cú thể tạo ra một số lượng lớn cỏc bản sao của một đoạn DNA mong muốn.
Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiờn cứu sinh học phõn tử, kỹ thuật PCR được nhanh chúng ỏp dụng rộng rói để chuẩn đoỏn cỏc bệnh về virus, vi khuẩn, cỏc bệnh ký sinh trựng và cho kết quả rất chớnh xỏc. Mặt khỏc, sự phõn tớch thành phần và trật tự nucleotide trờn phõn tử DNA trong hệ gen cũn cú ý nghĩa to lớn trong phõn loại cỏc loài sinh vật. Chớnh nhờ tớnh thực tiễn to lớn của kỹ thuật này mà tỏc giả của PCR, Kary Mulis, được tặng giải thưởng Nobel vào năm 1993.
Thực chất đõy là phương phỏp tạo dũng invitro, khụng cần đến sự hiện diện của tế bào và dựa trờn nguyờn tắc được trỡnh bày sau đõy:
7.2.1- Nguyờn tắc của phương phỏp PCR
Nguyờn tắc của phương phỏp là tạo lượng lớn cỏc đoạn DNA đặc thự từ DNA khuụn dựa trờn cơ sở hoạt động của DNA-polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung.
Cỏc yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm:
- Sợi khuụn DNA chỉ cần biết trỡnh tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhõn để thiết kế hai mồi oligonucleotide.
- Hai đoạn mồi ngắn để xỏc định cỏc điểm bắt đầu tổng hợp DNA. Là tớn hiệu chỉ hướng đi (5’ → 3’) của enzyme DNA-polymerase. Mồi dài khoảng 20 nucleotide và cỏc nucleotide ở hai đầu của mồi khụng tự kết hợp với nhau theo nguyờn tắc bổ sung.
- Cú đầy đủ cỏc loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP.
- Mụi trường đệm cung cấp ion Mg và nước tinh khiết khụng cú enzyme RNase và DNase.
- Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq)
Dung tớch tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 àl đến 50àl. Đặc điểm của phản ứng PCR là chọn lọc, nhậy và nhanh.
7.2.2- Cỏc bước tiến hành thớ nghiệm
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ và mỗi chu kỳ gồm 3 bước (Hỡnh 7- 2 và Hỡnh 7-3): 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ Biến tính Bổ sung mồi Bổ sung DNA -polymerase Trình tự mục tiêu Hỡnh 7-2: Cỏc bước thực hiện phản ứng PCR một chu kỳ
7.2.2.1- Bước 1 - Thực hiện qỳa trỡnh biến tớnh DNA bằng nhiệt
Đưa DNA vào dung dịch phản ứng (gồm cỏc thành phần cần thiết cho sự sao chộp), tăng nhiệt độ của dung dịch lờn tới 90ữ98°C, thời gian lưu tương ứng khoảng từ 30sữ1 phỳt. Tại nhiệt độ này, cỏc phõn tử DNA mạch kộp bị tỏch ra (do liờn kết hydrụ bị đứt), tạo nờn cỏc sợi đơn dựng để làm khuụn tổng hợp sợi mới.
7.2.2.2- Bước 2 - Thực hiện phản ứng lai
Sau bước 1, ngay lập tức nhiệt độ được hạ xuống từ từ và nhỏ hơn nhiệt độ Tm của mồi, vào khoảng 37ữ68°C và thời gian lưu 30sữ1 phỳt. Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với sợi khuụn. Mồi được tổng hợp húa học, cú mồi ngược và xuụi. Người ta cũn cú thể dựa vào trỡnh tự nucleotide ở đầu 3’ của khuụn để tổng hợp mồi. Sau đú bổ sung DNA-polymerase để kộo dài mồi.
7.2.2.3- Bước 3 - Tổng hợp mạch mới hay cũn gọi là kộo dài (extension) Nõng nhiệt phản ứng lờn 72°Ctrong vài chục giõy đến 1 phỳt để DNA- polymerase tổng hợp sợi mới. Trong thực tế, thời gian và nhiệt độ phản ứng phụ thuộc vào sợi DNA cần khuếch đại.
Kết thỳc một chu kỳ từ một DNA kộp mẹ tổng hợp 2 sợi DNA kộp con. Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25 đến 40 chu kỳ. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trỡ ở 72°C trong khoảng từ 5 đến 10 phỳt sao cho tất cả cỏc sợi đơn xoắn lại và tạo nờn sản phẩm của PCR. Sau đú hạ xuống 4°C để bảo quản sản phẩm.
Sản phẩm của PCR được kiểm tra bằng cỏch chạy điện di trờn gel agarose nồng độ từ 0,8%ữ2% để phỏt hiện sự đa hỡnh của cỏc đoạn DNA đặc thự, hoặc cỏc đoạn DNA bị thay đổi do cỏc tỏc nhõn nào đú (đột biến, tỏi tổ hợp).
Bổ sung mồi Biến tính Bổ sung mồi Biến tính Biến tính Bổ sung mồi Kéo dài Biến tính Bổ sung mồi Kéo dài Kéo dài Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3 Chu kỳ 4 Chu kỳ 5 Kéo dài Bổ sung mồi Biến tính Khuôn DNA Hỡnh 7-3: Sơđồ phản ứng PCR nhiều chu kỳ - 160 -
7.2.3- Cỏc yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
7.2.3.1- DNA mẫu làm khuụn
Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu DNA khụng được dài quỏ, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1ữ1,5kb.
Mẫu DNA tinh sạch sẽ cho kết quả tốt, tuy nhiờn, kỹ thuật chuẩn đoỏn bằng phương phỏp này vẫn đạt kết quả tốt trong trường hợp mẫu DNA khụng cần cú độ tinh sạch cao, như vết mỏu khụ, những mẫu vật khảo cổ (túc, múng tay người đó chết). Phương phỏp này cho phộp xỏc định DNA với một lượng