- gen điều hoà operator
G AATTC C T T A A
6.2- MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ
6.2.1- Húa biến nạp
Hiện tượng biến nạp là chỡa khúa giỳp ta hiểu biết cơ sở phõn tử của gen, cũng là cụng cụ để thực hiện cỏc thao tỏc tạo tớnh di truyền của vật sống. Theo Mandel và Higa cho thấy rằng, E. Coli trở nờn rất dễ bị biến nạp bởi DNA ngoại lai khi cỏc tế bào vi khuẩn được xử lớ trong mụi trường cú CaCl2 và trước đú được sốc nhiệt ở 42°C.
Húa biến nạp là phương phỏp sử dụng chất húa học, tạo điều kiện để đưa vector tỏi tổ hợp vào tế bào chủ. Quỏ trỡnh được thực hiện theo hai buớc sau: Xử lớ tế bào chủ trong dung dịch CaCl2 ở nhiệt độ thấp nhằm để thay đổi màng tế bào và ủ vector tỏi tổ hợp với tế bào chủ đó xử lớ.
Hiệu suất của phương phỏp húa biến nạp này vào khoảng 105đến 106tế bào biến nạp trờn 1mg DNA tỏi tổ hợp. Qua cỏc kết quả thực nghiệm, người ta thấy rằng, cỏc tế bào phỏt triển ở pha sớm đến pha giữa dễ được biến nạp hơn. Những nghiờn cứu sau này cho thấy việc xử lớ tế bào bằng cỏc ion kim loại húa trị hai như Mg+2, Mn+2 và Ba+2 cũng cho khả năng biến nạp lớn. Ngoài ra, hiệu suất biến nạp cũn phụ thuộc vào kớch thước của plasmid, plasmid càng nhỏ thỡ hiệu suất biến nạp càng cao.
6.2.2- Điện biến nạp
Nguyờn tắc: Sử dụng dũng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo lỗ nhỏ trờn màng sinh học của tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ DNA tỏi tổ hợp được dễ dàng.
Hiệu suất: Từ 109 đến 1010 tế bào biến nạp cho 1mg DNA tỏi tổ hợp, tuy nhiờn, lượng tế bào biến nạp bị chết nhiều cú khi lờn tới 70%. Hiệu suất của phương phỏp này phụ thuộc vào cỏc yếu tố sau:
- Độ mạnh của điện trường tỏc động khỏc nhau đối với cỏc loại tế bào khỏc nhau,
- Độ dài của hằng số thời gian (thời gian ngắt xung - ms). Theo nhiều nghiờn cứu, hầu hết đối với cỏc loại tế bào sinh vật, hiệu quả biến nạp cao khi hằng số thời gian đạt được khoảng 6ms,
- Nồng độ tế bào chủ,
- Nồng độ DNA tỏi tổ hợp,
- Giai đoạn phỏt triển của tế bào (tế bào quỏ già hoặc quỏ non đều khụng thớch hợp),
- Mụi trường dung dịch đệm,
- Cấu trỳc màng tế bào.
6.2.3- Biến nạp tế bào trần (protoplast)
Là phương phỏp chuyển DNA tỏi tổ hợp vào tế bào chủ đó được xử lớ bằng polyetylen glycol (PEG). Để tạo tế bào trần, người ta ủ tế bào với PEG nồng độ 30% đến 40%. Đõy là phương phỏp chuyển gen cú hiệu quả cao đối với tế bào thực vật. Bằng phương phỏp này, người ta đó nhận được cỏc cõy mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua nhiều thế hệ (Potrykus và cộng sự - 1995).
Ưu điểm: Tần số biến nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao. Cú thể chuyển gen vào tế bào protoplast của bất kỳ loại cõy nào. Đặc biệt là loại cõy cú giỏ trị kinh tế cao như lỳa, ngụ, đại mạch.
Nhược điểm: Việc tỏi sinh cõy protoplast cũn rất khú khăn ở một số loài cõy.
6.2.4- Phương phỏp bắn gen
Nguyờn tắc: Người ta sử dụng hạt kim loại nặng được bao bọc DNA và bắn trực tiếp vào tế bào.
Ưu điểm: Phương phỏp này cú thể biến nạp cho tất cả cỏc loại tế bào thực vật. Thao tỏc dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào.
Nhược điểm: Hiệu suất biến nạp thấp, thường xuyờn nhận được cõy biến nạp khảm (cõy cú tế bào biến nạp và tế bào khụng biến nạp).
Một số thành tựu đó đạt được bằng phương phỏp bắn gen: Năm 1988, Mc. Cabe và cộng sự đó nhận được cõy đậu tương biến nạp đầu tiờn bằng phương phỏp bắn gen. Năm 1990, Promm, Gordon, Kamm và cộng sự đó nhận được cõy ngụ biến nạp ở nhiều phũng thớ nghiệm. Những năm gần đõy cú hàng loạt cụng bố về biến nạp thành cụng ở lỳa. Năm 1996, Zthang và cộng sự đó biến nạp ở đu đủ, mớa và bụng. Điều đú đó khẳng định tớnh ưu việt của phương phỏp này.
6.2.5- Phương phỏp vi tiờm
Phương phỏp vi tiờm là phương phỏp sử dụng vi kim và kớnh hiển vi để đưa DNA tỏi tổ hợp vào mỗi tế bào nhất định.
Đõy là quỏ trỡnh lai ghộp cho tế bào bậc cao hoặc tế bào hợp tử. Tựy thuộc từng trường hợp cụ thể, người ta cú thể chọn phương phỏp sao cho việc đưa DNA tỏi tổ hợp vào tế bào cú hiệu quả cao.
Ưu điểm: Cú thể tối ưu lượng DNA tỏi tổ hợp đưa vào tế bào và quyết định đưa DNA vào loại tế bào nào. Đưa chớnh xỏc và thậm chớ vào tận nhõn của tế bào và cú thể quan sỏt được. Cỏc tế bào cú cấu trỳc nhỏ như hạt phấn, tế bào tiền phụi cũng cú thể tiến hành một cỏch chớnh xỏc. Cú thể biến nạp cho mọi giống cõy.
Nhược điểm: Một phỏt tiờm chỉ được một tế bào và thao tỏc cần phải khộo lộo và tỉ mỉ.
6.2.6- Tải nạp
Tải nạp là hiện tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector là virus từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, trong đú cú quỏ trỡnh chuyển gen và tỏi tổ hợp gen ở vi khuẩn nhờ thực khuẩn thể (Bacteriophage).
Thực nghiệm đó chứng minh được tải nạp ở E. Coli qua phage λ, phage P1 và ở Bacillus subtilis qua phage SP10 . So với cỏc phương phỏp trờn, tải nạp cho hiệu suất cao hơn.
Như vậy, đến nay đó cú nhiều phương phỏp húa học, húa lý, cơ học và sinh học để đưa DNA tỏi tổ hợp vào tế bào chủ. Tựy cỏc đối tượng và yờu cầu cụ thể, phương phỏp này hay phương phỏp khỏc cú hiệu quả và được sử dụng nhiều hơn.