- gen điều hoà operator
G AATTC C T T A A
6.3- KỸ THUẬT TÁCH DềNG (tạo dũng)
Kỹ thuật tỏch dũng bao gồm việc phải cài một mảnh (chuỗi) DNA lạ vào một vector (plasmide hoặc phage λ) bằng phương phỏp húa sinh. Sau đú, đưa phõn tử lai này vào tế bào chủ đó chọn lựa bằng phương phỏp biến nạp hoặc tải nạp. Trường hợp muốn tạo dũng tổng hợp enzyme thỡ mảnh DNA định cài phải mó húa cho gen cấu trỳc của một enzyme nào đú.
6.3.1- Mục đớch của sự tỏch dũng
- Thiết lập ngõn hàng bộ gen,
- Thiết lập ngõn hàng cDNA,
- Sản xuất protein, enzyme,
- Sản xuất vaccine,
- Sản xuất khỏng sinh.
6.3.2- Cỏc bước cơ bản của phương phỏp tỏch dũng
Quỏ trỡnh thực hiện cú thể thay đổi phụ thuộc vào nhõn tố tham gia và mục đớch của quỏ trỡnh tỏch dũng. Tuy nhiờn để tạo dũng, cần phải thực hiện cỏc bước sau:
6.3.2.1-Tỏch lập cỏc DNA lạ cần tạo dũng
Chọn và cắt DNA lạ của tế bào cho bằng một enzyme cắt hạn chế (RE). Phõn lập đoạn DNA (gen quớ) phự hợp với vector và mục đớch cần tạo dũng.
Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dũng một gen chưa biết, người nghiờn cứu cú thể tổng hợp húa học đoạn DNA cần tạo dũng khi dự đoỏn cấu trỳc protein do gen chỉ huy tổng hợp hoặc tổng hợp cDNA từ mRNA.
Tạo đầu dớnh khi cần thiết.
6.3.2.2-Chọn và xử lớ vector
Chọn vector cần phải chỳ ý những yờu cầu sau: độ lớn của gen lạ (đoạn cài), loại tế bào chủ tiếp nhận vector và phương phỏp ứng dụng.
Xử lớ vector: cắt vector bằng enzyme cắt hạn chế cựng loại với enzyme đó cắt DNA núi trờn (để tạo những vết cắt giống nhau, thuận tiện cho việc nối ghộp sau này). Khử nhúm phosphat bằng enzyme alkanline phosphotase để trỏnh hai đầu vector đúng kớn trở lại.
6.3.2.3-Tạo DNA tỏi tổ hợp (Vector tỏi tổ hợp)
Việc tạo DNA tỏi tổ hợp bằng cỏch ghộp DNA lạ vào vector đó được cắt cựng một enzyme cắt hạn chế loại II, khi đú, chỳng sẽ ghộp đụi những đầu dớnh lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung.
Một phản ứng ghộp nối xảy ra với sự cú mặt của enzyme DNA ligase của E. Coli hoặc phage T4 để hoàn chỉnh phõn tử lai.
6.3.2.4- Chuyển DNA tỏi tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương phỏp biến nạp hoặc tải nạp
Cụng đoạn này nhằm mục đớch sử dụng bộ mỏy của tế bào chủ để sao chộp vector tỏi tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao. Việc chuyển DNA tỏi tổ hợp vào tế bào vi khuẩn tức là làm cho vi khuẩn trở thành khả biến, nghĩa là cú khả năng thấm vector tỏi tổ hợp. Sự thấm này cú thể xảy ra một cỏch tự nhiờn hoặc được cảm ứng. Tuy nhiờn, nú sẽ phụ thuộc vào loại plasmid sử dụng làm vector và phụ thuộc vào sự định vị của vựng cài lắp chứa bờn trong vector mà người nghiờn cứu sẽ chọn phương phỏp biến nạp hoặc tải nạp.
Biến nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception), khụng cần sự tiếp xỳc giữa hai tế bào hoặc nhõn tố trung gian là phage hoặc virus. Biến nạp được thực hiện với vector chuyển gen là plasmid. Cú nhiều phương phỏp biến nạp như húa biến nạp, điện biến nạp, biến nạp tế bào trần, phương phỏp bắn gen và phương phỏp vi tiờm.
Tải nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception) qua nhõn tố trung gian là virus. Tải nạp được thực hiện với vector chuyển gen cú nguồn gốc là virus như phage, cosmid, ...
6.3.2.5-Phỏt hiện dũng cần tỡm
Cụng việc tiếp theo là kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn. Việc chọn lựa những chủng như ý muốn là khụng đơn giản, vỡ cỏch tiến hành thớ nghiệm trong một hỗn hợp khụng đồng nhất nờn cỏc dũng vi khuẩn cú thể mọc lờn theo ba khả năng:
- Tế bào vi khuẩn khụng nhận plasmid tỏi tổ hợp, - Tế bào nhận plasmid nhưng khụng cú gen lạ, - Tế bào vi khuẩn nhận được plasmid tỏi tổ hợp.
Tựy thuộc vào mục đớch nghiờn cứu mà người ta cú cỏc phương phỏp khỏc nhau để xỏc định dũng cần tỡm. Nếu mục đớch là nghiờn cứu đoạn gen chưa biết, người ta thường dựng đầu dũ. Nếu đoạn DNA đó biết (cDNA), cụng việc sẽ đơn giản và nhanh chúng.
6.3.2.6- Kiểm tra và thu nhận sản phẩm của gen tỏi tổ hợp
Tựy từng trường hợp cụ thể mà người nghiờn cứu đưa ra những phương phỏp kiểm tra thu hồi sản phẩm của gen tỏi tổ hợp. Nếu là mục đớch thiết lập ngõn hàng cDNA, ta phải tiến hành cỏc bước sau: Đầu tiờn người ta phải tỏch plasmid tỏi tổ hợp ra khỏi dịch nuụi cấy, sau đú, cắt plasmid tỏi tổ hợp bằng enzyme RE loại II và thu được hai băng DNA, một cú độ dài bằng khung vector, cũn băng khỏc cú độ dài tương ứng đỳng bằng cDNA. Cỏch kiểm tra lại cDNA đó được cắt bằng cỏch điện di trờn gel agaroza 0,8% và kiểm tra lại độ dài của những băng cDNA thu được. Những đoạn cú kớch thước khỏc nhau sẽ di chuyển những khoảng cỏch khỏc nhau trờn gel.
Nếu sản phẩm của gen tỏi tổ hợp là protein, enzyme, hormone, vaccine, khỏng sinh,... người ta cú thể thu nhận sản phẩm bằng phương phỏp chiết tỏch lắng lọc ly tõm kết tủa phõn đoạn hoặc trao đổi ion.
6.3.3- Một số phương phỏp xỏc định dũng cần tỡm
6.3.3.1-Phương phỏp lai axit nucleic
1,- Khỏi niệm đầu dũ:
Cỏc đầu dũ là những mảnh DNA được đỏnh dấu, cú khả năng nhận biết một chuỗi DNA hoặc RNA đồng đẳng qua lai húa.
2,- Đặc điểm của đầu dũ:
Là một đoạn axit nucleic (DNA hoặc RNA) sợi đơn. Đầu dũ phải bổ sung cỏc bazơ nitơ, đối song song với đoạn axit nucleic cần nhận biết. Đầu dũ phải so mốc được, đú là cỏc đầu đỏnh dấu phúng xạ.
3,- Cỏc loại đầu dũ:
cDNA làm đầu dũ cực tốt, ngoài ra, mRNA và oligonucleotide cũng cú thể làm đầu dũ. Nếu chuỗi DNA chưa biết trỡnh tự, người ta phải tinh sạch một lượng nhỏ protein tương ứng với DNA đó nghiờn cứu và từ đú tổng hợp đầu dũ. Cũn nếu một phần DNA phải so mốc đó biết thỡ cụng việc rất dễ dàng để tổng hợp một đầu dũ.
4,- Nguyờn tắc của phương phỏp lai axit nucleic:
Dựa vào khả năng biến tớnh khi nhiệt độ tăng và hồi tớnh khi hạ nhiệt độ từ từ của DNA. Khi tăng nhiệt độ của DNA lờn quỏ nhiệt độ sinh lý (thường ở khoảng 80 đến 95°C), hai sợi đơn DNA sẽ tỏch rời nhau do liờn kết hydro bị đứt. Khi hạ nhiệt độ từ từ của khối DNA đó biến tớnh cựng với cỏc điều kiện thớch hợp khỏc, cỏc mạch đơn bắt cặp trở lại. Sự bắt cặp chỉ cú thể xảy ra khi hai trỡnh tự DNA hoàn toàn bổ sung cho nhau. Tớnh đặc hiệu cực lớn của phản ứng lai này cho phộp bất kỳ trỡnh tự mạch đơn nào cũng tỡm gặp mạch bổ sung với nú, mặc dự chỳng nằm trong hàng triệu cỏc trỡnh tự DNA và RNA khỏc nhau. Cú thể dựng đồng vị phúng xạ đỏnh dấu để phỏt hiện đoạn lai.
5,- Cỏch tiến hành:
Chuẩn bị mẫu (đầu) dũ đó được đỏnh dấu bằng đồng vị phúng xạ hoặc húa chất. Biến tớnh dũng cần tỡm ở dưới dạng một sợi, sau đú hạ nhiệt độ từ từ, cỏc sợi đơn tương đồng bắt cặp với nhau. Sự bắt cặp xảy ra giữa DNA và DNA, RNA và DNA, RNA và RNA.
6.3.3.2-Phương phỏp sử dụng khỏng thể
1,- Nguyờn tắc:
Dựa vào phản ứng đặc trưng của một số protein và khỏng thể mà chỳng ta cú thể nhận biết được qua phản ứng đặc trưng đú như phản ứng tạo màu, phản ứng kết tủa.
2,- Cỏch tiến hành:
Chọn khỏng thể đặc trưng cho protein (thuốc thử cho protein). Tỏch protein được biểu hiện trong quỏ trỡnh tạo dũng. Ủ protein với khỏng thể đặc trưng. Sau đú tiến hành nhận biết thụng qua cỏc dấu hiệu của phản ứng đặc trưng giữa protein và khỏng thể.
3,- Ứng dụng:
Chủ yếu sử dụng trong y học với hai yờu cầu sau: DNA cần nghiờn cứu được gắn vào vector phải biểu hiện protein khi tạo dũng và đồng thời, vector tạo dũng phải là vector biểu hiện (vớ dụ như vector λgt11). Protein biểu hiện cần phải cú khỏng thể đặc trưng.
6.3.3.3- Phương phỏp phỏt hiện do mất hoạt tớnh vỡ xen đoạn
Nguyờn tắc: Dựa vào sự mất khả năng khỏng thuốc của vi khuẩn mang vector tỏi tổ hợp khi chỳng được nuụi cấy trong mụi trường khỏng sinh.
Phạm vi sử dụng: Phương phỏp này dựng cho vector cú từ hai gen khỏng thuốc trở lờn, vớ dụ như vector pBR322 . Trong plasmid pBR322 cú hai gen khỏng thuốc AmPR và TetR. Trờn cỏc gen này cú những điểm nhận biết của cỏc RE nơi cài đặt DNA lạ. Khi gắn DNA lạ vào một trong hai gen núi trờn thỡ gen nhận đoạn cài mất khả năng khỏng thuốc. Quan sỏt những khuẩn lạc bị mất gen khỏng thuốc, chứng tỏ những khuẩn lạc đú cú chứa gen cần tạo dũng.
Ưu điểm của phương phỏp là ớt tốn kộm so với phương phỏp lai. 6.3.3.4- Phương phỏp phỏt hiện do thay đổi kiểu hỡnh
1,- Nguyờn tắc:
Dựa vào sự thay đổi màu sắc của khuẩn lạc, chứng tỏ rằng, khuẩn lạc đú cú chứa gen lạ.
2,- Cỏch tiến hành:
Chuẩn bị hai mẫu thử nghiệm mà plasmid tạo dũng cú chứa gen lacZ (vớ dụ như dóy pUC), một mẫu để so sỏnh cũn mẫu kia để cài DNA lạ vào gen lacZ. Sau đú, nuụi cấy cả hai mẫu trong mụi trường cú chất cảm ứng X-Gal (5
brom-4chloro-3indolyl D-galactopynoside). Chất cảm ứng này bị phõn hủy bởi enzyme β-galactosidase tạo ra galactose và X (dẫn xuất indol), ngoài mụi trường, dẫn xuất này bị oxy húa cho màu xanh đậm.
Qua quan sỏt, ta thấy plasmid khụng chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh do gen lacZ tổng hợp enzyme β-galactosidase. Cũn plasmid thứ 2 cho khuẩn lạc màu trắng, điều đú chứng tỏ nú chứa DNA lạ được cài trong gen lacZ và chọn những khuẩn lạc màu trắng.
6.4- NGÂN HÀNG GEN (Genomic library)
Ngõn hàng bộ gen của một sinh vật là tập hợp cỏc trỡnh tự DNA cấu thành bộ gen được gắn vào vector, nú chỉ biểu diễn tổng số của gen. Ngõn hàng này được tạo ra từ một bộ sưu tập DNA tỏi tổ hợp cả cỏc chuỗi mó húa lẫn cỏc chuỗi khụng mó húa. Khỏc với ngõn hàng cDNA, ngõn hàng bộ gen cú thể được thiết lập bất kỳ loại tế bào nào của sinh vật nghiờn cứu.
Cỏc bước thiết lập ngõn hàng gen:
- Tỏch và làm sạch DNA của sinh vật,
- Cắt DNA thành những đoạn cú kớch thước xỏc định bằng enzyme RE loại II - thụng thường, người ta sử dụng EcoRI,
- Vector được chọn để tạo dũng gen thường là cosmid hoặc phage λ cũng được xử lý bởi EcoRI,
- Tạo vector tỏi tổ hợp và đúng gúi trong vỏ phage,
- Đưa vector tỏi tổ hợp vào tế bào chủ và tạo dũng,
- Xỏc định đặc tớnh và biểu hiện của dũng vi khuẩn vừa lập,
- Tiến hành sàng lọc, nghĩa là phải tỏch những vector nào cú đoạn DNA ưa chuộng, từ đú xõy dựng ngõn hàng bộ gen.
Đặc điểm và ứng dụng:
- Ngõn hàng gen chứa cỏc đoạn DNA lớn hơn 100 lần so với cDNA.
- Giải mó thụng tin di truyền chứa trong bộ gen, đặc biệt là cấu trỳc intron và exon của một gen xỏc định.
- Tạo dũng những trỡnh tự DNA khụng mó húa nằm cạnh cỏc gen mó húa và đúng vai trũ quyết định trong sự điều hũa biểu hiện của gen.