Trung bình cộng (X ), trung bình nhân hiệu giá kháng thể (X Geo), độ lệch chuẩn, giá trị td theo các phƣơng pháp thống kê trong nghiên cứu y học và phần mềm Microsoft Execel 7.0.
Chƣơng 3: KẾT QỦA VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết qủa khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng Shigella
3.1.1. Kết quả khảo sát hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào Bảng 3.1. Kết quả hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào Bảng 3.1. Kết quả hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào
Chủng giống Hình dạng khuẩn lạc Hình thái tế bào
Shigella dysenteriae SG Khuẩn lạc dạng S, màu trắng, trong, tròn, bờ đều, đƣờng kính khoảng 1,5 – 2mm Điển hình trực khuẩn gram âm, nhỏ, hình que, hình thái tế bào
đồng nhất.
Shigella flexneri HN1
Shigella boydii 116
Shigella sonnei 285
Qua bảng: 3.1, hình 3.1 và hình 3.2 cho thấy:
Về hình dạng khuẩn lạc: Tất cả các chủng Shigella khảo sát đều là khuẩn lạc điển hình dạng S, màu trắng, trong, tròn, bờ đều, đƣờng kính khoảng 1,5 – 2mm.
Về hình thái tế bào: Tất cả các chủng Shigella khảo sát đều là trực khuẩn gram âm, nhỏ, hình que, hình thái tế bào đồng nhất.
Từ kết quả trên chúng tôi nhận xét: Bốn chủng Shigella có nguồn gốc từ Viện Pasteur Paris – Pháp ở dạng đông khô đƣợc bảo quản ở -80oC, là chủng có độ thuần khiết cao. Sau khi chủng đƣợc phục hồi trên môi trƣờng thạch LB, đây là môi trƣờng đặc trƣng cho Shigella vì thế trực khuẩn phát triển mạnh, hình thái tế bào và hình dạng khuẩn lạc của các chủng sản xuất điển hình trực khuẩn lỵ.
Kết quả này phù hợp với hồ sơ chủng gốc và phù hợp với đặc tính sinh học của
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Shigella
3.1.2. Kết quả khảo sát tính chất sinh hóa
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tính chất sinh hóa của các chủng Shigella
Chủng giống di động Mannit Urea
Lên men đƣờng
Glucose Mannitol Lactose Saccharose
Shigella dysenteriae SG (-) (-) (+) (-) (-) (-) Shigella flexneri HN1 (-) (-) (+) (+) (-) (±) Shigella boydii 116 (-) (-) (+) (+) (-) (-) Shigella sonnei 285 (-) (-) (+) (+) (±) (-) Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Chứng (+)
Kết qủa ở bảng 3.2 và hình 3.3 cho thấy:
Về tính chất di động: Tất cả các chủng nuôi cấy đều thể hiện âm tính sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng thạch mềm mannit, vi khuẩn mọc thẳng theo đƣờng que cấy theo hình 3.3 chứng tỏ trực khuẩn không có lông.
Kết qủa ở bảng 3.2 và hình 3.4 cho thấy:
Khả năng phân giải Urea: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, các chủng kiểm tra đều không phân giải urea trong môi trƣờng nuôi cấy. Môi trƣờng vẫn giữ nguyên màu vàng ban đầu.
Về tính chất lên men các loại đường: Tất cả các chủng kiểm tra đều lên men đƣờng glucose. Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Chứng (+)
Hình 3.5. Khả năng lên men đƣờng của chủng Shigella dysenteriae
Hình 3.7. Khả năng lên men đƣờng của chủng Shigella boydii
+ Chủng Sh. dysenteriae chỉ lên men đƣờng glucose, không lên men đƣờng mannitol, lactose và saccharose. Hình 3.5 cho thấy vi khuẩn đã lên men đƣờng glucose rất mạnh, ống môi trƣờng chứa đƣờng glucose chuyển sang màu vàng rơm khi nhỏ thuốc thử xanh bromothymol vào. Trong khi đó các ống môi trƣờng chứa đƣờng khác và ống chứng không có đƣờng đã chuyển thành màu xanh lam khi cho thuốc thử vào.
+ Chủng Sh. flexneri vừa lên men đƣờng glucose và mannitol, lên men yếu với đƣờng saccharose và không lên men đƣờng lactose. Hình 3.6 cho thấy vi khuẩn đã lên men đƣờng glucose và mannitol rất mạnh, hai ống môi trƣờng đã chuyển sang màu vàng rơm hoàn toàn khi nhỏ thuốc thử xanh bromothymol vào. Ống môi trƣờng chứa đƣờng saccharose lên men yếu, tạo màu môi trƣờng có màu vàng nhạt.
+ Chủng Sh. boydii lên men đƣờng glucose, mannitol và không lên men đƣờng saccharose và lactose. Hình 3.7 cho thấy hai ống môi trƣờng chứa đƣờng glucose và mannitol có màu vàng rơm, các ống môi trƣờng còn lại vẫn giữ nguyên màu xanh lam khi nhỏ thuốc thử xanh bromothymol vào. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Chủng Sh. sonnei lên men đƣờng glucose và mannitol, lên men yếu đƣờng lactose và không lên men đƣờng saccharose. Hình 3.8 biểu hiện màu vàng rơm với ống môi trƣờng chứa đƣờng glucose và mannitol, màu vàng nhạt với ống môi trƣờng chứa đƣờng lactose khi nhỏ thuốc thử xanh bromothymol vào. Chứng âm và môi trƣờng chứa đƣờng saccharose cho màu xanh lam.
Từ kết quả trên chúng tôi nhận xét:
Các chủng đƣa vào nghiên cứu để sản xuất kháng nguyên ở trên có tính chất sinh hóa phù hợp hồ sơ chủng giống gốc và tính chất này điển hình với trực khuẩn Shigella.
3.1.3. Tính chất huyết thanh của chủng giống
Bảng 3.3. Kết qủa phản ứng ngƣng kết kháng nguyên – kháng thể
Chủng giống
Kháng huyết thanh mẫu chuẩn Nƣớc muối sinh lý Nhóm A Nhóm B Nhóm C Nhóm D Sh. dysenteriae SG (+++) (-) (-) (-) (-) Sh. flexneri HN1 (-) (+++) (-) (-) (-) Sh. boydii 116 (-) (-) (+++) (-) (-) Sh. Sonnei 285 (-) (-) (-) (+++) (-) (+++) : Ngƣng kết nhiều (-) : Không ngƣng kết NMSL NHÓM A KHT NHÓM B KHT NHÓM CKHT NHÓM D KHT Chủng Sh. dysenteriae SG Chủng Sh. flexneri HN1
Hình: 3.9. Phản ứng ngƣng kết giữa các chủng với kháng huyết thanh đặc hiệu nhóm A, B, C và D mẫu Sanofi - Pháp
Chủng Sh. boydii 116 Chủng Sh. sonnei 285
Kiểm tra tính đặc hiệu của chủng giống bằng kháng huyết thanh đặc hiệu mẫu của hãng Sanofi Pasteur - Pháp nhóm A, B, C và D. Chủng cần kiểm tra đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thạch LB ở 37o
C trong vòng 18 – 22 giờ. Kết qủa bảng 3.3 và hình 3.9 cho thấy:
- Chủng Shigella dysenteriae SG tạo ngƣng kết nhiều (+++), rõ ràng và nhanh trong vòng 2 phút với kháng huyết thanh mẫu nhóm A thấy đƣợc bằng mắt thƣờng. Không tạo ngƣng kết với kháng huyết thanh mẫu nhóm B, C và D.
- Chủng Shigella flexneri HN1tạo ngƣng kết nhiều (+++), rõ ràng và nhanh trong vòng 1 phút với kháng huyết thanh mẫu nhóm B, không tạo ngƣng kết với kháng huyết thanh mẫu nhóm A, C và D khi nhìn bằng mắt thƣờng.
- Chủng Shigella boydii 116 ngƣng kết nhiều, rõ ràng (+++) nhanh trong vòng 2 phút, thấy đƣợc bằng mắt thƣờng với kháng huyết thanh mẫu nhóm C, không tạo ngƣng kết với nhóm huyết thanh nhóm A, B và D.
- Chủng Shigella sonnei 285 tạo ngƣng kết nhiều (+++), rõ ràng và nhanh trong vòng 2 phút với kháng huyết thanh mẫu nhóm D, không tạo ngƣng kết với kháng huyết thanh mẫu nhóm A, B và C khi nhìn bằng mắt thƣờng.
Tất cả 4 chủng khảo sát đều không tạo ngƣng kết (-) với nƣớc muối sinh lý, hoàn toàn là một huyền dịch màu trắng đục.
Khi nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh mục tiêu sau cùng làm thế nào để có thể thu đƣợc nhiều kháng thể nhất. Việc khởi đầu là phải chọn cho đƣợc chủng giống có kháng nguyên đặc hiệu nhằm gây đƣợc một đáp ứng miễn dịch mạnh và thu đƣợc kháng thể đặc hiệu cao. Do đó, việc kiểm tra chất lƣợng của các chủng giống nhƣ trên trƣớc khi dùng để nuôi cấy sản xuất kháng nguyên là rất cần thiết. Vì thế, ngoài việc kiểm tra hình thái, đặc tính sinh hóa của chủng giống, chúng tôi còn tiến hành kiểm tra tính chất huyết thanh nhằm để xác định chúng có đầy đủ các kháng nguyên đặc hiệu cần thiết hay không.
Từ kết quả thu đƣợc ở trên chúng tôi nhận xét:
Các chủng giống Shigella đƣa vào nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh:
Shigella dysenteriae SG, Shigella flexneri HN1, Shigella boydii 116 và Shigella sonnei
285 nhận từ viện Pasteur Paris – Pháp là các chủng tạo ngƣng kết đặc hiệu với kháng huyết thanh mẫu cùng nhóm, không gây phản ứng chéo với các nhóm huyết thanh khác. Điều này cho thấy các chủng có chứa đầy đủ các kháng nguyên đặc hiệu cần thiết nhằm kích thích cơ thể tạo đƣợc đáp ứng miễn dịch.
Kết quả này chứng tỏ rằng quá trình giữ chủng giống ở dạng đông khô trong điều kiện nhiệt độ âm tại Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt đảm bảo chủng ổn định. Kỹ thuật này một lần nữa chứng minh sự ƣu việc trong quá trình bảo quản chủng.
Qua kết quả nghiên cứu đƣợc ở trên chúng tôi nhận thấy 4 chủng trên đảm bảo đầy đủ các đặc tính sinh học cần thiết, thỏa mãn các yêu cầu chủng giống để đƣa vào sản xuất kháng nguyên gây miễn dịch.
3.2. Nghiên cứu quy trình sản xuất kháng nguyên
3.2.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến chất lƣợng kháng nguyên
Bảng 3.4. Kết quả chất lƣợng kháng nguyên trên 2 loại môi trƣờng khác nhau
Loạt TN
Chủng
giống Nhiệt độ Thời gian
Môi trƣờng thạch 7,2 Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng Đậm độ 109 tbvk /ml Đậm độ (X) Tính đặc hiệu Đậm độ 109 tbvk /ml Đậm độ (X ) Tính đặc hiệu TN 1 Shigella dysenteriae SG 37oC 22 giờ 44 47 ± 2,6 (+++) 45 48,3 ± 2,8 (+++) TN 2 48 (+++) 50 (+++) TN 3 49 (+++) 50 (+++) TN 1 Shigella flexneri HN1 60 60 ± 1,0 (+++) 63 62,3 ± 2,1 (+++) TN 2 59 (+++) 64 (+++) TN 3 61 (+++) 60 (+++) TN 1 Shigella boydii 116 43 43,3 ± 2,1 (+++) 44 46 ± 2,0 (+++) TN 2 46 (+++) 48 (+++) TN 3 47 (+++) 46 (+++) TN 1 Shigella sonnei 285 48 46 ± 2,0 (+++) 47 49 ± 2,0 (+++) TN 2 44 (+++) 49 (+++) TN 3 46 (+++) 51 (+++) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả ở bảng 3.4 cho ta thấy:
Khi nuôi cấy các chủng trên hai loại môi trƣờng khác nhau với cùng thể tích môi trƣờng, cùng điều kiện nuôi cấy và thực hiện ở 3 lần thí nghiệm trên mỗi chủng. Sau khi nuôi cấy, canh khuẩn đƣợc thu trên cùng thể tích nƣớc muối sinh lý. Tiến hành kiểm tra chất lƣợng kháng nguyên trên cơ sở đậm độ, tính đặc hiệu và thu đƣợc kết quả:
- Đối với chủng Shigella dysenteriae SG
+ Khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch 7,2. Huyền dịch vi khuẩn có trung bình cộng đậm độ là 47 ± 2,6 tbvk/ml. Huyền dịch vi khuẩn tạo đƣợc ngƣng kết nhiều, rõ ràng với kháng huyết thanh mẫu Shigella dysenteriae (+++).
+ Khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng. Huyền dịch vi khuẩn có trung bình cộng đậm độ là 48,3 ± 2,8 tbvk/ml. Huyền dịch vi khuẩn tạo đƣợc ngƣng kết nhiều, rõ ràng với kháng huyết thanh mẫu Shigella dysenteriae (+++).
- Đối với chủng Shigella flexneri HN1
+ Khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch 7,2. Huyền dịch vi khuẩn có trung bình cộng đậm độ là 60 ± 1,0 tbvk/ml. Huyền dịch vi khuẩn tạo đƣợc ngƣng kết nhiều, rõ ràng với kháng huyết thanh mẫu Shigella flexneri (+++).
+ Khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng. Huyền dịch vi khuẩn có trung bình cộng đậm độ là 62,3 ± 2,1 tbvk/ml. Huyền dịch vi khuẩn tạo đƣợc ngƣng kết nhiều, rõ ràng với kháng huyết thanh mẫu Shigella flexneri (+++).
- Đối với chủng Shigella boydii 116
+ Khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch 7,2. Huyền dịch vi khuẩn có trung bình cộng đậm độ là 43,3 ± 2,1 tbvk/ml. Huyền dịch vi khuẩn tạo đƣợc ngƣng kết nhiều, rõ ràng với kháng huyết thanh mẫu Shigella boydii (+++).
+ Khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng. Huyền dịch vi khuẩn có trung bình cộng đậm độ là 46 ± 2,0 tbvk/ml. Huyền dịch vi khuẩn tạo đƣợc ngƣng kết nhiều, rõ ràng với kháng huyết thanh mẫu Shigella boydii (+++).
- Đối với chủng Shigella sonnei 285
+ Khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch 7,2. Huyền dịch vi khuẩn có trung bình cộng đậm độ là 46 ± 2,0 tbvk/ml. Huyền dịch vi khuẩn tạo đƣợc ngƣng kết nhiều, rõ ràng với kháng huyết thanh mẫu Shigella sonnei (+++).
+ Khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng. Huyền dịch vi khuẩn có trung bình cộng đậm độ là 49 ± 2,0 tbvk/ml. Huyền dịch vi khuẩn tạo đƣợc ngƣng kết nhiều, rõ ràng với kháng huyết thanh mẫu Shigella sonnei (+++).
- Trên cả 4 chủng nuôi cấy ở hai loại môi trƣờng, cùng nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đều thu đƣợc trung bình cộng đậm độ kháng nguyên trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng cao hơn so với trên môi trƣờng thạch 7,2.
- Kháng nguyên sản xuất trên 2 loại môi trƣờng có tính đặc hiệu cao, ngƣng kết nhiều và rõ ràng (+++) với kháng huyết thanh mẫu các nhóm cùng nhóm và không ngƣng kết với các nhóm huyết thanh còn lại.
Chúng ta biết rằng trong cơ thể sống luôn diễn ra quá trình trao đổi chất để sản sinh năng lƣợng cung cấp cho các hoạt động sống của vi sinh vật. Đối với vi sinh vật quá trình sinh trƣởng và phát triển liên quan đến nhiều yếu tố bao gồm: nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, pH…. Các yếu tố này quyết định đến tốc độ sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật [5,7,53].
Trong sản xuất kháng nguyên chúng ta không chỉ quan tâm đến khả năng sinh trƣởng thu đƣợc nhiều sinh khối mà sinh khối thu đƣợc phải chứa đầy đủ kháng nguyên đặc hiệu, đó chính là mục tiêu quan trọng của nhà sản xuất.
Qua kết quả trên chúng tôi có nhận xét: Cả hai loại môi trƣờng nuôi cấy sản xuất kháng nguyên đều cho kháng nguyên có đậm độ, tính đặc hiệu cao. Ở môi trƣờng thạch dinh dƣỡng kháng nguyên thu đƣợc có đậm độ có cao hơn nhƣng không nhiều so với môi trƣờng thạch 7,2. Tuy nhiên thạch dinh dƣỡng là môi trƣờng phải nhập nội giá thành đắt gấp nhiều lần so với môi trƣờng thạch 7,2 và không chủ động trong sản xuất. Trong khi đó thạch 7,2 là môi trƣờng do Công Ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt sản xuất với giá thành thấp và có thể chủ động trong sản xuất. Nhƣ vậy, trong sản xuất ở quy mô lớn chúng ta nên chọn môi trƣờng thạch 7,2 để sản xuất kháng nguyên, điều này giúp giảm giá thành của sản phẩm cuối cùng.
3.2.2. Ảnh hƣởng của yếu tố bất hoạt đến chất lƣợng kháng nguyên Bảng 3.5. Kết quả chất lƣợng kháng nguyên Bảng 3.5. Kết quả chất lƣợng kháng nguyên
Kháng nguyên Yếu tố bất hoạt Đặc hiệu Thời gian ngƣng kết (phút)
Shigella dysenteriae Formol 5% (++) 2 100oC/2 giờ (+++) 1 Shigella flexneri Formol 5% (++) 2 100oC/2 giờ (+++) 1 Shigella boydii Formol 5% (++) 3 100oC/2 giờ (+++) 1 Shigella sonnei Formol 5% (++) 2 100oC/2 giờ (+++) 1
Qua bảng 3.5 cho thấy:
- Khi bất hoạt kháng nguyên Shigella dysenteriae bằng formol 5% thu kháng nguyên có tính đặc hiệu thấp, ngƣng kết ít (++) với kháng huyết thanh mẫu, thời gian ngƣng kết là 2 phút. Trong khi đó, bất hoạt kháng nguyên bằng nhiệt (100o
C/2 giờ) thu kháng nguyên có tính đặc hiệu cao, ngƣng kết nhiều và rõ ràng (+++) với kháng huyết thanh mẫu Shigella dysenteriae, thời gian ngƣng kết chỉ có 1 phút.
- Khi bất hoạt kháng nguyên Shigella flexneri bằng formol 5% thu kháng nguyên có tính đặc hiệu thấp, ngƣng kết ít (++) với kháng huyết thanh mẫu, thời gian ngƣng kết là 2 phút. Trong khi đó, bất hoạt kháng nguyên bằng nhiệt (100o
C/2 giờ) thu kháng nguyên có tính đặc hiệu cao, ngƣng kết nhiều và rõ ràng (+++) với kháng huyết thanh mẫu Shigella flexneri, thời gian ngƣng kết chỉ có 1 phút.
- Khi bất hoạt kháng nguyên Shigella boydii bằng formol 5% thu kháng nguyên có tính đặc hiệu thấp, ngƣng kết ít (++) với kháng huyết thanh mẫu, thời gian ngƣng kết là 3 phút. Trong khi đó, bất hoạt kháng nguyên bằng nhiệt (100oC/2 giờ) thu kháng nguyên có tính đặc hiệu cao, ngƣng kết nhiều và rõ ràng (+++) với kháng huyết thanh mẫu Shigella boydii, thời gian ngƣng kết chỉ có 2 phút.
- Khi bất hoạt kháng nguyên Shigella sonnei bằng formol 5% thu kháng nguyên có tính đặc hiệu thấp, ngƣng kết ít (++) với kháng huyết thanh mẫu, thời gian ngƣng kết là 2 phút. Trong khi đó, bất hoạt kháng nguyên bằng nhiệt (100oC/2 giờ) thu kháng nguyên có tính đặc hiệu cao, ngƣng kết nhiều và rõ ràng (+++) với kháng huyết thanh mẫu Shigella sonnei, thời gian ngƣng kết chỉ có 1 phút.
Trên cả 4 loại kháng nguyên khi bất hoạt bằng nhiệt 100oC/2 giờ đều cho thấy có tính đặc hiệu cao hơn, ngƣng kết nhiều và nhanh hơn so với bất hoạt bằng formol 5% khi làm phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh mẫu cùng nhóm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kháng nguyên kích thích đáp ứng miễn dịch của Shigella chủ yếu là kháng