- Các kết quả thu đƣợc trong quá trình nghiên cứu đƣợc xử lý bằng các phần mềm có sẵn trong thiết bị HPLC, quang phổ UV – VIS.
- Sử dụng các phƣơng pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toàn học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Office Excel để tính toán: phƣơng trình hồi qui tuyến tính bậc nhất, kết quả trung bình, độ lệch, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tƣơng đối, độ thu hồi khi xử lý các kết quả thực nghiệm và đánh giá thẩm định phƣơng pháp.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỊNH DANH THỰC VẬT
Toàn bộ mẫu nấm Linh chi nghiên cứu đƣợc định danh bởi bởi TS. Nguyễn Phƣơng Đại Nguyên – trƣờng Đại học Tây Nguyên. Các mẫu nấm Linh chi đều đƣợc xác định là loài Ganoderma lucidum.
3.2 MÔ TẢ HÌNH THỂ
Hình thể các mẫu nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) đƣợc mô tả trong bảng sau: Bảng 3. 1: Mô tả hình thể Tên mẫu Quả thể Hình ảnh GLT – 1
Mũ nấm hình hạt đậu. Mặt trên màu nâu đỏ, bóng loáng nhƣ đánh vecni, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 12 – 15 cm, đƣờng kính 1,5 – 2,5 cm, màu nâu đỏ bóng. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLT – 2
Mũ nấm hình hạt đậu. Mặt trên màu nâu đỏ sẫm đến nâu đen, bóng loáng nhƣ đánh vecni, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu nâu nhạt với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 12 – 15 cm, đƣờng kính 1,5 – 2,5 cm, màu nâu đen bóng. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLT – 3
Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu đỏ bóng, nhạt dần từ cuống nấm đến rìa, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, đều. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 7 – 10 cm, đƣờng kính 1,5 – 2,5 cm, màu nâu đen bóng. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLT – 4
Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu đen, bóng, nhạt dần từ cuống nấm đến rìa, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 8 – 9 cm, đƣờng kính 1 – 2 cm, màu nâu đen bóng. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLT – 5
Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu đỏ, màu không đều nhau, có những vết trắng, không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra; mép nhẵn, hơi lƣợn sóng và có màu vàng nâu. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 11 – 13 cm, đƣờng kính 1 – 2 cm, màu nâu đen. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLT – 6
Mũ nấm hình thận, hóa gỗ. Mặt trên màu nâu nhạt, không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, đều. Mặt dƣới màu vàng nhạt với các lỗ nhỏ li ti. Không cuống. Mùi
thơm nhẹ, vị đắng.
GLT – 7
Mũ nấm hình thận, hóa gỗ. Mặt trên màu nâu nhạt, không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, đều. Mặt dƣới màu vàng nhạt với các lỗ nhỏ li ti. Không cuống. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLT – 8
Mũ nấm hình quạt, hóa gỗ. Mặt trên màu nâu đỏ, không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Không cuống.
GLT – 9
Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu, nhiều bột, không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng, màu vàng nâu. Mặt dƣới màu vàng với các lỗ nhỏ li ti. Cuống ngắn. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLN – 1
Mũ nấm hình thận đến hình quạt. Mặt trên màu nâu đỏ bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 8 – 9 cm, đƣờng kính 1 – 2 cm, màu nâu đen bóng. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLN – 2
Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu đỏ bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, đều, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 4 – 5 cm, đƣờng kính 1 – 2 cm. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
GLN – 3
Mũ nấm hình quạt, hóa gỗ. Mặt trên màu nâu đỏ, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, đều, hơi lƣợn sóng và màu vàng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Không cuống. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
Từ những đặc điểm hình thái của 12 mẫu nấm Linh chi trên cùng mô tả trong bản bổ sung dƣợc điển Việt Nam, có thể đƣa ra đặc điểm hình thể nấm Linh chi nhƣ sau: Thể quả dạng hình thận, hình hạt đậu hay hình quạt, hóa gỗ, cứng. Mặt trên màu nâu nhạt, nâu vàng, nâu đỏ hoặc nâu đen, bóng hoặc không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nhạt đến nâu nhạt với các lỗ nhỏ li ti. Không cuống hoặc cuống hình trụ, đính lệch, dài 4 cm đến 15 cm, đƣờng kính 1 cm đến 3,5 cm, màu nâu đỏ đến nâu đen. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
3.3 MÔ TẢ BỘT DƢỢC LIỆU
Các bột nấm Linh chi đều có những đặc điểm chung nhƣ sau: Bột màu nâu vàng. Soi dƣới kính hiển vi thấy: Sợi nấm rải rác hoặc tụ thành đám, không màu hoặc nâu nhạt, mảnh, hơi cong, phân nhánh hoặc không phân nhánh, đƣờng kính 2,5 µm đến 6 µm. Bào tử hình trứng, màu nâu, đứng riêng lẻ hay tụ thành đám, dài 8 µm đến 12 µm, rộng 5 µm đến 8 µm, đỉnh trơn nhẵn, lớp vỏ ngoài không màu, lớp vỏ trong có nhiều chỗ lồi ra.
Hình 3.2: Bột nấm Linh chi GLT – 2
Hình 3.3 Bột nấm Linh chi GLT – 3
Hình 3.5: Bột nấm Linh chi GLT – 5
Hình 3.6: Bột nấm Linh chi GLT – 6
Hình 3.8: Bột nấm Linh chi GLT – 8
Hình 3.9: Bột nấm Linh chi GLT – 9
Hình 3.11: Bột nấm Linh chi GLN – 2
Hình 3.12: Bột nấm Linh chi GLN – 3
3.4 XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM
Bảng 3.2: Độ ẩm của 12 mẫu nấm Linh chi Tên mẫu Khối lƣợng cốc (g) Khối lƣợng cốc và bột nấm trƣớc khi sấy (g) Khối lƣợng cốc và bột nấm sau khi sấy (g) Độ ẩm (%) GLT – 1 48,9091 49,9122 49,7502 16,15 48,2574 49,2607 49,0987 16,14 48,8815 49,8855 49,7233 16,16 Trung bình 16,15 GLT – 2 49,8153 50,8186 50,6566 15,20 48,2650 49,2965 49,1168 15,20 48,3782 49,3808 49,22669 15,35 Trung bình 15,25 GLT – 3 48,8211 49,8297 49,6983 13,04 49,1028 50,1082 49,9769 13,06 47,4791 48,4829 48,3519 13,05 Trung bình 13,05 GLT – 4 48,9091 49,9113 49,7968 11,43 48,2650 49,2678 49,1529 11,46 48,8815 49,8846 49,7696 11,46 Trung bình 11,45 GLT – 5 49,8153 50,8188 50,6863 13,20 48,3782 49,3821 49,2486 13,30 49,1028 50,1078 49,9741 13,30 Trung bình 13,20 GLT – 6 48,2650 49,2704 49,1409 12,88 47,4791 48,4839 48,3545 12,93 48,8815 49,8845 49,7552 12,89 Trung bình 12,90 GLT – 7 48,9091 49,9111 49,7874 12,35 49,1028 50,1057 49,9813 12,40 48,3782 49,3807 49,2569 12,30 Trung bình 12,35 GLT – 8 49,8153 50,8178 50,6863 13,12 48,2574 49,2606 49,1294 13,08 48,8815 49,8853 49,7538 13,10 Trung bình 13,10 GLT – 9 48,2650 49,2695 49,1171 15,17 47,4791 48,4839 48,3307 15,25 48,9091 49,9141 49,7615 15,18 Trung bình 15,20 GLN – 1 49,1028 50,1066 49,9475 15,85
48,8815 49,8896 49,7293 15,90 48,8211 49,8261 49,6658 15,95 Trung bình 15,90 GLN – 2 48,2574 49,2586 49,1625 9,6 47,4791 47,4809 47,3817 9,9 48,2650 49,2671 49,1679 9,9 Trung bình 9,8 GLN – 3 49,1028 50,1056 49,9612 14,40 48,9091 49,9126 49,7674 14,47 48,8815 49,8855 49,7401 14,48 Trung bình 14,45
Nhƣ vây, tất cả các mẫu nấm Linh chi đều có độ ẩm không vƣợt quá 17,0%, đạt chỉ tiêu độ ẩm theo nhƣ Dƣợc điển Trung Quốc và Dƣợc điển Việt Nam IV bản bổ sung. Do đó, chỉ tiêu về độ ẩm của nấm Linh chi có thể để giới hạn là 17,0%.
3.5 ĐỊNH TÍNH NẤM LINH CHI BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC
Hệ dung môi: Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (15:5:1) cho Rf các vết quá thấp, do đó tỷ lệ đƣợc điều chỉnh thành ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1).
Trong 3 hệ dung môi lựa chọn khảo sát, hệ dung môi: Dichloromethan – methanol (9:1) tách đƣợc nhiều vết và rõ ràng nhất. Chất đối chiếu acid ganoderic A sau khi phun thuốc thử H2SO4 10 %/ EtOH có màu xanh da trời. Đối chiếu màu sắc và Rf = 0,32 của chất chuẩn acid ganoderic A với các mẫu thử, phát hiện acid ganoderic A trong các mẫu nấm Linh chi GLT - 1, GLT - 2, GLT - 3, GLT - 4, GLT - 5, GLN - 1.
Các sắc ký đồ với hệ dung môi dichloromethan – methanol (9:1) (hình 3.13, hình 3.14, hình 3.15):
Hình 3.13:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol
ở bƣớc sóng 254 nm
Hình 3.14:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol
Hình 3.15:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol sau khi phun thuốc thử H2SO4 10 %/ EtOH
Chú thích:
(1): GLT – 1; (2): GLT – 2; (3): GLT – 3; (4): GLT – 4; (5): GLT – 5; (6) GLT – 6; (7): GLT – 7; (8): GLT – 8; (9): GLT – 9; (10): GLN – 1; (11): GLN – 2; (12):
GLN – 3; (13) Nấm Linh chi Hàn Quốc (dƣợc liệu đối chiếu); (14): chất đối chiếu acid ganoderic A
Các sắc ký đồ với hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) (hình 3.16, hình 3.17, hình 3.18).
Hình 3.16: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) ở bƣớc sóng 254 nm
Hình 3.17:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) ở bƣớc sóng 366 nm
Hình 3.18:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) sau khi phun thuốc thử
H2SO4 10%/ EtOH Chú thích:
(1): GLT – 1; (2): GLT – 2; (3): GLT – 3; (4): GLT – 4; (5): GLT – 5; (6) GLT – 6; (7): GLT – 7; (8): GLT – 8; (9): GLT – 9; (10): GLN – 1; (11): GLN – 2; (12):
GLN – 3; (13) Nấm Linh chi Hàn Quốc (dƣợc liệu đối chiếu); (14): chất đối chiếu acid ganoderic A
Qua những khảo sát trên, lựa chọn quy trình định tính nấm Linh chi bằng sắc ký lớp mỏng nhƣ sau:
1. Pha tĩnh: Bản mỏng Silicagel GF254
2. Pha động: Dichloromethan – methanol (9:1) 3. Chuẩn bị mẫu:
- Dung dịch thử: Cân khoảng 2 g bột thô dƣợc liệu, thêm 30 ml methanol, đun hồi lƣu 30 phút, lọc. Bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn trong 2 ml methanol.
- Dung dịch đối chiếu: Cân khoảng 2 g bột thô Linh chi (mẫu chuẩn) tiến hành chiết nhƣ mẫu thử (hoặc dung dịch acid ganoderic A chuẩn 0,1 mg/ml)
4. Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi đƣợc 10 cm đến 12 cm, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí, quan sát bản mỏng ở bƣớc sóng 254 nm và sau khi phun thuốc thử hiện màu H2SO4 10%/ EtOH.
- Yêu cầu: Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết giống với các vết của dung dịch đối chiếu (hoặc chất đối chiếu) về màu sắc và vị trí.
3.6 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG ACID GANODERIC A TRONG NẤM LINH CHI BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC GANODERIC A TRONG NẤM LINH CHI BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC
3.6.1 Tối ƣu quá trình chiết acid ganoderic A (GAA)
- Thời gian siêu âm: Siêu âm với thời gian 3h30, 4h cho kết quả tƣơng đƣơng với thời gian 3h, do đó lựa chọn thời gian chiết là 3h.
- Dung môi chiết: Siêu âm với dung môi chloroform cho kết quả định lƣợng thấp hơn so với khi siêu âm với dung dịch NaHCO3 5% với cùng thời gian siêu âm, do đó lựa chọn dung môi chiết là dung dịch NaHCO3 5%.
- Phƣơng pháp chiết: Kết quả thu đƣợc cho thấy phƣơng pháp siêu âm chiết đƣợc hàm lƣợng cao hơn phƣơng pháp ngâm chiết trong cùng thời gian. Do đó lựa chọn phƣơng pháp siêu âm.
3.6.2 Khảo sát các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC
3.6.2.1 Lựa chọn thành phần pha động
Theo tài liệu tham khảo [16] chúng tôi lựa chọn pha động là acetonitril : acid acetic 1%, sau đó tiến hành các thay đổi tỷ lệ acetonitril và acid acetic 1% (20:80);
(30:70); (40:60). Kết quả tỷ lệ acetonitril : acid acetic (30: 70) cho thời gian lƣu của chất phân tích hợp lý và các pic tách nhau hoàn toàn.
3.6.2.3 Lựa chọn nhiệt độ cột
Trong nhiều trƣờng hợp, nhiệt độ cũng là một yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả tách sắc ký. Nói chung khi tăng nhiệt độ trong một phạm vi nhất định thƣờng cho kết quả tách sắc ký tốt hơn. Tuy nhiên, nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến sự tồn tại và độ bền của chất phân tích cũng nhƣ của pha tĩnh và pha động. Tiến hành các phân tích thử nghiệm thay đổi nhiệt độ buồng cột (30°C, 40°C và nhiệt độ phòng) với các điều kiện chạy cố định:
- Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút - Thể tích tiêm: 20 µl
- Thời gian phân tích: 40 phút
- Pha động: acetonitril – acid acetic 1% (30:70) Kết quả lựa chọn nhiệt độ buồng cột sắc ký là 30°C.
3.6.3 Quy trình định tính, định lƣợng acid ganoderic A bằng phƣơng pháp HPLC HPLC
Định tính acid ganoderic A bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) dựa vào so sánh thời gian lƣu tR, phổ PDA của mẫu (dung dịch) thử và mẫu (dung dịch) đối chiếu.
Sau khi khảo sát các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC và các điều kiện xử lý mẫu, quy trình phân tích acid ganoderic A đƣợc tiến hành nhƣ sau:
* Điều kiện HPLC: - Cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) - Bƣớc sóng phát hiện: 254 nm - Nhiệt độ cột: 30°C - Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút - Thể tích tiêm: 20 µl
- Thời gian phân tích: 40 phút
* Chuẩn bị mẫu
+ Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 2 g bột nấm linh chi cho vào bình nón nút mài dung tích 250 ml, thêm 40 ml dung dich NaHCO3 5% siêu âm trong khoảng 2 giờ, sau đó chiết lấy dịch kiềm. Tiếp tục thêm 40 ml dung dịch NaHCO3 5% vào cắn siêu âm trong khoảng 30 phút và chiết dịch kiềm. Tiếp tục siêu âm cắn với 20 ml dung dịch NaHCO3 5% trong 30 phút. Tâp trung dịch chiết kiềm, acid hóa bằng dung dịch acid hydrochloric 6N đến pH < 3. Dịch sau khi acid hóa đƣợc chiết bằng chloroform 3 lần (40 x 30 x 30 ml). Tập trung dịch chloroform và bay hơi đến cắn. Hòa cắn trong 20 ml methanol. Lọc qua giấy lọc Millipore 0,45 µm.
+ Mẫu trắng: MeOH 100%
+ Dung dịch đối chiếu: cân chính xác khoảng 10mg acid ganoderic A cho vào bình định mức 20ml, hòa tan trong khoảng 15 ml methanol, sau đó thêm methanol vừa đủ thể tích , lắc đều (dung dịch có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml).
3.6.4 Thẩm định phƣơng pháp
3.6.4.1 Độ đặc hiệu
Tiến hành phân tích theo các điều kiện sắc ký ở trên với mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử có nồng độ tƣơng ứng. Kết quả cho thấy trên sắc đồ của mẫu chuẩn, chỉ xuất hiện một pic rõ ràng của acid ganoderic A. Đối với mẫu trắng, trên sắc ký đồ không có pic nào tƣơng ứng với thời gian lƣu của pic acid ganoderic A. Sắc ký đồ mẫu thử có pic có thời gian lƣu trùng với thời gian lƣu của pic acid ganoderic A trong mẫu đối chiếu. Phổ tử ngoại của pic acid ganoderic A trong mẫu thử giống phổ tử ngoại của mẫu đối chiếu acid ganoderic A. Vậy phƣơng pháp có tính đặc hiệu. Sắc ký đồ đƣợc ghi trong hình 3.19:
(1) (3)
(2) (4)
Hình 3.19: Sắc ký đồ dung dịch acid ganoderic A chuẩn (1), dung dịch thử (2), dung dịch trắng (3) và so sánh phổ UV của pic acid ganoderic A của dung dịch
chuẩn – thử
3.6.4.2 Tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn acid ganoderic A nồng độ 0,244 mg/ml.
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống
Số lần tiêm Diện tích pic Thời gian lƣu
1 3246643 22,239 2 3249151 22,254 3 3168966 22,325 4 3195474 22,281 5 3209117 22,296 6 3128404 22,267