Hệ dung môi: Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (15:5:1) cho Rf các vết quá thấp, do đó tỷ lệ đƣợc điều chỉnh thành ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1).
Trong 3 hệ dung môi lựa chọn khảo sát, hệ dung môi: Dichloromethan – methanol (9:1) tách đƣợc nhiều vết và rõ ràng nhất. Chất đối chiếu acid ganoderic A sau khi phun thuốc thử H2SO4 10 %/ EtOH có màu xanh da trời. Đối chiếu màu sắc và Rf = 0,32 của chất chuẩn acid ganoderic A với các mẫu thử, phát hiện acid ganoderic A trong các mẫu nấm Linh chi GLT - 1, GLT - 2, GLT - 3, GLT - 4, GLT - 5, GLN - 1.
Các sắc ký đồ với hệ dung môi dichloromethan – methanol (9:1) (hình 3.13, hình 3.14, hình 3.15):
Hình 3.13:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol
ở bƣớc sóng 254 nm
Hình 3.14:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol
Hình 3.15:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol sau khi phun thuốc thử H2SO4 10 %/ EtOH
Chú thích:
(1): GLT – 1; (2): GLT – 2; (3): GLT – 3; (4): GLT – 4; (5): GLT – 5; (6) GLT – 6; (7): GLT – 7; (8): GLT – 8; (9): GLT – 9; (10): GLN – 1; (11): GLN – 2; (12):
GLN – 3; (13) Nấm Linh chi Hàn Quốc (dƣợc liệu đối chiếu); (14): chất đối chiếu acid ganoderic A
Các sắc ký đồ với hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) (hình 3.16, hình 3.17, hình 3.18).
Hình 3.16: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) ở bƣớc sóng 254 nm
Hình 3.17:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) ở bƣớc sóng 366 nm
Hình 3.18:Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) sau khi phun thuốc thử
H2SO4 10%/ EtOH Chú thích:
(1): GLT – 1; (2): GLT – 2; (3): GLT – 3; (4): GLT – 4; (5): GLT – 5; (6) GLT – 6; (7): GLT – 7; (8): GLT – 8; (9): GLT – 9; (10): GLN – 1; (11): GLN – 2; (12):
GLN – 3; (13) Nấm Linh chi Hàn Quốc (dƣợc liệu đối chiếu); (14): chất đối chiếu acid ganoderic A
Qua những khảo sát trên, lựa chọn quy trình định tính nấm Linh chi bằng sắc ký lớp mỏng nhƣ sau:
1. Pha tĩnh: Bản mỏng Silicagel GF254
2. Pha động: Dichloromethan – methanol (9:1) 3. Chuẩn bị mẫu:
- Dung dịch thử: Cân khoảng 2 g bột thô dƣợc liệu, thêm 30 ml methanol, đun hồi lƣu 30 phút, lọc. Bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn trong 2 ml methanol.
- Dung dịch đối chiếu: Cân khoảng 2 g bột thô Linh chi (mẫu chuẩn) tiến hành chiết nhƣ mẫu thử (hoặc dung dịch acid ganoderic A chuẩn 0,1 mg/ml)
4. Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi đƣợc 10 cm đến 12 cm, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí, quan sát bản mỏng ở bƣớc sóng 254 nm và sau khi phun thuốc thử hiện màu H2SO4 10%/ EtOH.
- Yêu cầu: Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết giống với các vết của dung dịch đối chiếu (hoặc chất đối chiếu) về màu sắc và vị trí.
3.6 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG ACID GANODERIC A TRONG NẤM LINH CHI BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC